药理学实验方法
第四讲 毒性试验
一·急性毒性（50% Lethal Dose，LD50）试验 （一）定义：引起一半实验动物死亡的药物剂量。
（二）意义：LD50反映药物毒性大小的指标。该指标即准确又具有代表性。 （三）测定LD50的原理
质反应的量效曲线的几种形式。
死亡频数 死亡频数 真数剂量 Log LD50 对数剂量
死亡率死亡率
从对数剂量与死亡频数的正态分布中可知, LgLD50恰在横轴中点, 按此剂量给药, 动物恰好死亡一半, 因在正态分布中, 横轴中点恰是均数所在处, 所以LgLD50恰是全部实验动物最小致死剂量对数的平均值（即真数剂量的几何平均值）。
从对数剂量与死亡率关系的正S型曲线中可知, LgLD50恰为S型曲线中点所对应的横轴上的对数值, 因此S型曲线中点所对应的纵轴(死亡率)恰为50% 。
据此，如果求出正态曲线横轴中点的对数值或正S型曲线中点 所对应的横轴上的对数值, 即为LgLD50。
· 测定LD50就是测定平均最小致死量。
真数剂量
LogLD50 对数剂量 11
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例如：
鼠号 1 2 3 4 最小致死量 5 6 7 8 （mg）
= （5+6+7+8）÷4 = 6.5 mg
X
如果给予6.5mg, 1、2号鼠死亡; 3、4号鼠存活。6.5mg既是平均最小致死量又是半数致死量。 看起来测定半数致死量似乎很简单，其实则不然。因为，对于大多数药物来说，要想准确测出
最小致死量是不可能的，这是因为除了洋地黄等极少数药物外， 绝大多数药物都不能使动物立即死亡。但我们可以将动物分成若干组，每组给予不同剂量，观察一段时间后记录各组死亡数，用适当的公式可以计算出半数致死量。为了把要测定的LD50值包括在内，一般各组间剂量之差按等比级数给予。
要计算几个等比数量的均数，不能用求算数均数的方法进行，必须求其几何均数，即对数剂量
的算数均数。请看下列一组数据：
x1 x2 x3 x4
1 10 100 1000 1+10+100+1000
算数均数 = = 277.75 4
这显然不能作为半数致死量。
4
几何均数 = 1 ×10×100×1000 = 31.62
Lg1 + Lg10 + Lg100 + Lg1000 4
= 1.5
反对数 101.5 = 31.62
如将此量给予上述动物, 刚好有两只死亡, 两只存活，为LD50。
（四）测定方法
LD50的测定方法很多，最常用的是寇氏法。 1·计算方法：
计算公式：Lg LD50 = XK －d （∑Pi －0.5） XK ……P = 100%组的对数剂量。 d………对数组间距。 Pi …….各组死亡率。 2．条件：
（１）组间剂量等比。 （２）各组动物数相等。
（３）最小剂量组死亡率（Pn） = 0%；最大剂量组死亡率（Pm） = 100% 。如果Pn > 20%，或Pm
< 80%则不能使用此法。
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（五）测定LD50应注意的问题
1·分组的随机性：各组动物在性别、体重、等要保证均匀一致性。
2·动物及数量：常用小鼠，体重20±2g，雌雄均可。正式实验每组10～20只。
3·剂量应按几何级数排列：临近两组剂量比一般为1：0.7～0.85。测定新药时先将剂距加大（1：0.3～0.5）,初步找出死亡率为0%和100%的剂量。
4·给药途经：以IV. IP. PO.为主。其中必须包括临床推荐给药途径。 5·容量限制：不管哪种途径给药，小白鼠的给药容量不能超过0.2ml/10g。灌胃以不超过0.3 ml/10g为限。
6·观察时间：动物一般在两日内死亡，但应观察7天。同时记录其他反应。 （六）等比溶液的配制
1。相邻两组剂量比为1：r ，如r = 0.85
2．设每组所用药液总量为d, 如每组10只小鼠, 每鼠注射药液0.5 ml , 共需5ml，为留有余地，并使d能被1- r正除，可取d = 6 ml。
3．设上限组（1号液）浓度为C，整个实验所需浓度为C的药液总量为D，则：
D?1?X?40ml
1?r
4．取出d量(6ml)为1号液, 余量加水d至D, 再取d量为2号液。 5．余量加水d至D, 再取d量为3号液。 6．余量加水d至D, 再取d量为4号液。 7．余量加水d至D, 再取d量为5号液。 8．……………………..，……………………..
计算LD50公式的来源（Karber氏法）
1LogLD50?XK?d??(Pi?pi?1)?XK?d(?Pi?0.5)
2100％ D 此证明详见公式演变部分。可据对数剂量与死亡率的关系曲线通过面积法求出此公式。 P E C 50％ H G 0％ A Xi F XK B X 13 （log LD50） 药理学实验方法
d
上图横坐标为对数剂量[x], 纵坐标为死亡率（P），G为正S形曲线中点，它对应的纵坐标H点P = 50%(0.5)，横坐标的F点X = LgLD50；A点P = 0， D点P = 1，B点Xk为P = 100%时的对数剂量，由图可知：：
矩形AFED = AF . AD = LgLD50 × 1 = LgLD50
曲边△XiFG = GCE （三边对应相等） ∴矩形AFED = 曲边形AXiCD = LgLD50
则LgLD50 = 矩形AXKCD － 曲边形XiXKC 1
曲边形X1XKC = d ∑ （pi ＋ pi +1）------相当于多个梯形面积的总和。 又矩形AXKCD = AXK . AD = XK × 1 = XK 1
∴LgLD50 = XK － d ∑ （ pi + pi + 1 ） 2
上述推导过程可用直观图形表示:
LgLD50 = ＝ ＝ －
公式的演变
1
LgLD50 = XK －d ∑(Pi ＋Pi ＋1) 2
1
= XK － d ［（P1＋P2） ＋（P2 ＋P3） ＋…（PK - 2+ Pk – 1）+（Pk - 1+ Pk）］ 2
1
= XK － d ［P1＋P2 ＋P2 ＋P3 ＋…PK －2+ Pk － 1+Pk － 1+ Pk］ 2
1
= XK － d ［2∑Pi －（P1 ＋Pk）］ 2
= XK －d （∑pi － 0.5）
P1 = 0%；Pk = 100%（1.0） ?
LD50简化测定方法
计算公式:
LD50?Log?1(Logd?5?aA?a?LogDd)
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D……高剂量组剂量 (mg, g/kg). ? d…….低剂量组剂量 (mg, g/kg). ? A…….高剂量组死亡率的机率单位. ? a…….低剂量组死亡率的机率单位.
例如, 用灌胃法测定某药的LD50, 结果如下：
高剂量（D=120mg/kg）组， 死17只， 活3只，死亡率 = 85%，查表, 机率单位A = 6.03; 低剂量（d=100mg/kg）组， 死8只， 活12只，死亡率 = 40%，查表, 机率单位a = 4.75;
?
LD50?Log?1(Log100?
附：中草药毒性实验
5?4.75120?Log)?103.12mg/kg
6.03?4.75100
由于中草药毒性低，有部分中草药的LD50不能测出，常测其最大耐受量。
本法取体重18～22g的健康小鼠，雌雄各半，随机分几组，每组动物灌服不同浓度的受试药物一次，每只0.5ml，观察7天内动物的中毒反应或有无死亡。以死亡为主要观察指标。如有死亡，则以刚不出现死亡组为准，此时的用药量即为小鼠的最大耐受量。然后按公式计算出耐受量倍数。以耐受人用量口服100倍以上为安全。
计算公式如下：
成人平均体重（50000g） 毎只小鼠的耐受药量 小鼠的最大耐受量倍数＝?小鼠平均体重（20g）成人每日用量举例：升麻葛根汤，人的用量是45g/日，每只小鼠的耐受量为2.85 g, 小鼠的平均体重为20g, 观察7
天，无一只死亡。小鼠的最大耐受量倍数＝
2.85 50000g??158倍
4520如因受试药物的浓度或体积限制, 预计一次给药无法测出LD50时, 可做一次或一日内最大耐受
量试验。既选用拟临床试验的给药途径，以动物能耐受的最大浓度、最大体积的药量一次或一日内2～3次给与动物。如用小鼠，不得少于20只，雌雄各半。要连续观察7天，并详细记录动物反应情况。
常用小白鼠进行实验，体重18～20g，雌雄均可。也可用大白鼠、家兔、猫、狗等。每次5～10只，尾静脉或腹腔注射一定量药物，观察有无不良反应（惊厥、步态不稳、瘫痪、竖毛、呼吸抑制等）或死亡。连续观察24～48 h。
例如，给20g小鼠iv 柴胡注射液0.5 ml不引起死亡，临床用量为2ml，人的体重为50kg，按体重计算小白鼠用量为人用量的625倍。
一般认为，小白鼠最大耐受量相当于人用量的100倍以上就比较安全，可以供临床应用。大部分中草药制剂都是相当安全的。
当归注射液为125倍；金银花注射液为375倍；柴胡注射液为625倍； * 中草药的提纯物毒性增强，都需测LD50.
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