液相色谱-串联质谱法检测人血浆中碘帕醇

液相色谱-串联质谱法检测人血浆中碘帕醇*

张美微1,袁想妹2，陆优丽1，许凯文3，朱建民1，张卫2，李水军1 【摘 要】摘要：目的 建立一种稳定的检测人血浆碘帕醇的液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，并对该方法进行性能评价。方法 以氘代同位素作为内标，人血浆样品经直接沉淀法前处理后进样，用XSelectTM HSS PFP色谱柱进行分离，用含0.1%甲酸-5 mmol/L九氟戊酸-10%乙腈的水溶液等度洗脱；正离子电喷雾离子化扫描检测，多反应监测(MRM)扫描分析，建立检测血浆碘帕醇的LC-MS/MS方法。根据CLSI EP10-A和CLSI C62-A，评价该方法的线性范围、正确度、精密度、选择性、基质效应、稳定性。结果 LC-MS/MS检测血浆碘帕醇的线性范围为1～1 000 μgI/mL(以含碘量计算)；低、中、高浓度(3、50、800 μgI/mL)血浆质控品检测结果与理论靶值的偏移为-6.1%～7.5%，重复性以不精密度表示，CV<6.6%(4.6%～6.6%)，期间精密度CV<8.5%(6.6%～8.5%)，方法回收率为92.5%～95.9%，基质效应为88.8%～95.2%；方法选择性良好，溶血和脂血因素均不影响检测结果。血浆样品在室温下放置最好不要超过48 h，在-80 ℃下反复冻融不超过2次，经前处理后的血浆样品4 ℃自动进样器中放置不超过72 h，碘帕醇可稳定检测。结论 建立并评价了一种可靠的检测人血浆碘帕醇的LC-MS/MS方法。 【期刊名称】临床检验杂志 【年(卷),期】2018(036)012 【总页数】5

【关键词】液相色谱-串联质谱法；碘帕醇；同位素稀释 ·临床检验技术研究·

基金项目：上海市徐汇区中心医院院级课题。

肾小球滤过率(glomerular filtration rate，GFR)是衡量肾功能的重要指标之一，其异常常见于各种原发性和继发性肾脏疾病。传统的GFR检测方法包括检测内源性标记物(血清肌酐和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C)清除率[1-2]和外源性标记物(菊粉、锝99m-二乙烯三胺五乙酸或铬51-乙二胺四乙酸)清除率。肌酐清除率影响因素较多、重复性不佳[3]；金标准即菊粉清除率方法繁琐[4-5]；同位素标记物清除率虽然可准确检测GFR，但具有一定放射性[6]；上述标志物在临床上应用均具有一定局限性。而非放射性的碘造影剂碘海醇，在国外曾被广泛应用于评价GFR[7-8]，其准确度高且可以避免连续输注的繁琐操作和收集尿液的时间消耗。

近年来国内临床上已逐渐淘汰使用碘海醇，目前已无可售的碘海醇注射液。碘帕醇作为临床使用的第二代非离子水溶性含碘造影剂，其注射液来源方便，价格便宜，安全性好，作为造影剂在国内被临床上广泛使用。碘帕醇几乎全部经肾小球过滤，而不被肾小管重吸收，血浆蛋白质结合率低。国外文献报道用碘帕醇清除率能够准确可靠地评估大鼠GFR[9]，但血浆碘帕醇检测与评估人GFR的研究在国内少有报道，其临床研究数据不多。

利用碘帕醇血浆清除率评估人GFR的临床研究中，注射方式(多采用单剂量注射法)、采血点的确认与组合(单点法、两点法、三点法、四点法或多样本法)、模型选择(根据血药浓度时间曲线进行一室模型、二室模型或多室模型拟合)均是影响其结果准确性的重要因素[10]，需要通过实验摸索最佳条件，而准确检测血浆碘帕醇的方法是临床实验顺利进行的前提条件。因此，本研究旨在建立并评价实验室自建的液相色谱-串联质谱技术(LC-MS/MS)检测血浆碘帕醇的方

法，为后续临床应用碘帕醇清除率评价患者肾功能提供可靠的检测手段。

1 材料和方法

1.1 主要仪器与试剂 API 4000串联质谱仪(美国Applied Biosystems公司)；液相色谱系统(日本岛津公司)由LC-20AD输液泵、DGU-20A3在线脱气仪、SIL-HTc自动进样器组成；色谱柱为Waters XSelectTM HSS PFP(100×2.1 mm，3.5 μm，美国waters公司)。标准品为碘帕醇(纯度≥98%，批号10-ANR-140-1)，内标品为碘帕醇-d8(纯度≥95%，批号2-MSC-148-3)，均购自加拿大TRC公司。CP225D电子天平(精度0.01 mg，德国Sartorius公司)；Vortex Genie2涡旋混合器(美国Scientific Industries公司)；Mikro 22R冷冻高速离心机(德国Hettich公司)；Eppendorf移液器(德国Eppendorf公司)；乙酸(HPLC级，美国CNW公司)；甲醇(HPLC级)、乙腈(HPLC级)均购自德国Merck公司；实验用水为本实验室采用Millipore纯水系统(美国Millipore公司)自制。

1.2 血浆样品 空白人血浆样品来自经确认未曾使用碘帕醇制剂的健康志愿者，肝素钠抗凝，-80 ℃储存。

1.3 样品制备 精密称量512.24 mg碘帕醇标准品于10 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解后配制成浓度为50.2 mg/mL碘帕醇储备液，相当量24.6 mgI/mL(以含碘量计算)的储备液，-80 ℃储存。

碘帕醇工作液的配制：用50%甲醇将上述24.6 mgI/mL碘帕醇储备液按比例稀释为5 000、2 500、500、50、10、5 μgI/mL 6个不同浓度的标准曲线工作液和20 000、4 000、250、15、5 μgI/mL 5个不同浓度的质控品工作液；每个检测批次的标准曲线工作液和质控品工作液均为新鲜配制。