1 CRISPR-Cas系统的研究进展
CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)，即串联的、间隔的短回文重复序列，最早在1987年研究大肠杆菌的碱性磷酸酶基因时被发现[1]。随后在细菌和古细菌的基因组中也发现大量存在CRISPR，研究证实它能够保护自身抵御外来病毒和质粒的入侵[2]，作用机制是依靠crRNA(CRISPR RNA)和tracrRNA(trans-activating crRNA)结合并引导Cas蛋白对外源DNA进行特异性降解[3]。已发现的CRISPR-Cas系统有三种类型：Ⅰ型，Ⅱ型和Ⅲ型，其中以Ⅱ型最为简单，只需一种Cas蛋白，即通过RNA介导核心蛋白Cas9识别并切割靶序列，引起DNA双链断裂[2]。
受自然界中CRISPR-Cas系统的启发，主要对来自于化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的Ⅱ型CRISPR-Cas系统进行人为改造和利用，目前已经将其发展成为一种新型的基因编辑技术，实现基因敲除、插入、定点突变和组合编辑[4]，并成功应用于大肠杆菌、酿酒酵母、家蚕、果蝇和人类细胞等[5]。和传统的基因编辑技术相比，这一新技术具有成本低、操作简便、效率高的优点[6]。
2 CRISPR-Cas系统的组成与机制
典型的Ⅱ型CRISPR-Cas系统基因座包含tracrRNA基因、Cas蛋白编码基因(cas9、cas1、cas2和csn2)、
[6]
CRISPR基因座（引导序列、间隔序列和重复序列）这三个部分。
Ⅱ型CRISPR-Cas系统的作用机制可分为三个阶段，第一是高度可变间隔序列的获得（图1），第二是CRISPR-Cas系统基因座的表达，第三是对外源遗传物质的降解[6]（图2）。
Cas1、Cas2和Csn2蛋白与新间隔序列的获得相关。与间隔序列同源的外源遗传物质上的原间隔序列(protospacer)，其下游存在一段保守序列，被称为PAM(protospacer adjacent motifs)[7]。当外源噬菌体或质粒首次入侵时，宿主菌通过识别PAM，选取合适的原间隔序列，切割并整合到CRISPR基因座中，形成新的间隔序列。
正常情况下CRISPR基因座的表达水平很低[8]，但是当外源噬菌体或质粒再次入侵时，CRISPR基因座的表达水平快速上调，首先转录形成前体crRNA(pre-crRNA)，随后在tracrRNA的指导下，由Cas9和核酸内切酶RNaseⅢ加工为含有一个间隔序列和部分重复序列的成熟crRNA。
成熟的crRNA与tracrRNA形成crRNA:tracrRNA复合物，并结合Cas9形成核糖核蛋白复合物，crRNA上的间隔序列与外源DNA的原间隔序列互补配对，从而引导具有核酸内切酶活性的Cas9对DNA双链进行特异性切割。
图1 宿主菌获得新间隔序列的机制
[6]
Fig.1 New spcacer of CRISPR acquisition
图2 Ⅱ型CRISPR-Cas系统表达及降解外源遗传物质的机制
[6]
Fig.2 Schematic of CRISPR/Cas9 mediated DNA double-strand break
3 双质粒CRISPR-Cas9基因敲除系统
本实验中采用双质粒CRISPR-Cas9系统[5]对大肠杆菌进行“无痕”基因敲除，涉及到的两个质粒分别为pCas和pTargetF（图3）。该系统将crRNA:tracrRNA复合物融合为人工设计的sgRNA(single guide RNA)（图4），省去了将pre-crRNA加工为成熟crRNA的步骤，只需设计长度为20 nt，与靶序列互补的N20序列。pCas包含cas9基因及其原始启动子，将Cas9导向pTargetF的pMB1复制子的sgRNA-pMB1，提高编辑效率的λ-Red重组酶基因(gam、bet和exo)，卡那霉素抗性基因kanR和温敏复制子repA101。pTargetF包含sgRNA序列，N20序列，pMB1复制子和壮观霉素抗性基因aadA。
首先向待敲除菌株中电转入pCas，通过L-阿拉伯糖(L-arabinose)诱导，使重组酶Gam、Bet和Exo表达。Gam能与RecBCD核酸外切酶结合，抑制其活性，防止对外源DNA的降解。Exo为核酸外切酶，可以结合在双链DNA末端，从5’向3’降解DNA单链，产生3’突出端。Bet能结合在3’突出端上，保护其不被降解，并介导DNA互补链的退火[9]。
然后将外源DNA敲除片段和含有N20序列的pTargetF-X（X代表待敲除的目的基因）同时电转入宿主细胞。其中，外源DNA敲除片段由目的基因的上游同源臂和下游同源臂融合而成（图5）。设计引物时，对上游同源臂的反向引物和下游同源臂的正向引物进行修饰，使其能反向互补，第一步PCR将上下游同源臂片段分别扩增出来。第二步PCR将上下游同源臂片段共同作为模板，利用两者间存在反向互补序列，能在退火时形成一段重叠链并延伸，从而实现融合。
pTargetF-X转录形成的sgRNA通过N20序列与目的基因的同源序列相互配对，引导与之结合的Cas9识别靶序列进行切割，形成DNA双链断裂。随后通过同源重组，依靠外源DNA敲除片段对断裂的DNA进行替换[10]，从而使目的基因缺失。
对于宿主细胞中pTargetF的去除，向培养基中添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)，诱导pCas转录形成sgRNA-pMB1，结合Cas9对pTargetF的pMB1复制子进行切割破坏。去除pTargetF而含有pCas的菌株可直接
进行下一轮的敲除。对于无抗菌株的获得，将菌株于42℃下过夜培养，即可去除温敏质粒pCas。
图3 质粒pCas和pTargetF
[22]
Fig.3 Plasmid pCas and pTargetF
图4 将crRNA:tracrRNA复合物融合为sgRNA
Fig.4 Construction of sgRNA
图5 重叠PCR构建融合片段
Fig.5 Construction of fused fragment by overlap extension PCR
参考文献:
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[2] Brouns S J J, Jore M M, Lundgren M, et al. Small CRISPR RNAs guide antiviral defense in prokaryotes[J]. Science, 2008, 321 (5891): 960-964.
[3] 李聪, 曹文广. CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术研究进展[J]. 生物工程学报, 2015, 31 (11): 1531-1542. [4] 刘妮, 陆沁, 刘娟, 陈航. CRISPR/Cas系统最新研究进展[J]. 生物技术通报, 2017, 33 (2): 53-58.
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[7] Mojica F J, Díez V C, García M J, et al. Short motif sequences determine the targets of the prokaryotic CRISPR defence system[J]. Microbiology, 2009, 155 (3): 733-740.
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[9] 张全, 高会杰, 佟明友. Red重组技术研究进展[J]. 中国生物工程杂志, 2006, 26 (1): 81-86.
[10] Hsu, Patrick, Nbsp, et al. Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering[J]. Cell, 2014, 157 (6): 1262-1278.
大肠杆菌CRISPR-Cas9系统基因敲除简介
