质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。
三、操作步骤
1．限制性内切酶反应一般在灭菌的0.2或0.5ml PCR薄壁离心管中进行。
2. 酶切反应体系（10ul）：
酶解缓冲液（10×buffer） 1 ul
限制性内切酶 0.5 ul EcoR I(7.5U)
底物DNA（质粒） x ul（依质粒浓度而定）
灭菌ddH2O 加至10 ul
限制性内切酶最后加入，手弹混匀或用吸头轻轻上下吹吸，混匀后6000 r/min，离心15s。37℃水浴消化2h。
3.酶切完毕，取5ul酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，鉴定酶切反应效果，必须用DNA分子量标准物同时进行电泳以确定DNA片段的大小。如果酶切不完全，可继续.酶解消化反应，或加入适量酶后继续反应。
5. 经电泳观察酶切反应完全后，将上述反应液置65℃水浴中10～15min，中止酶切反应，将剩余酶切产物保存于?C20℃备用。
四、注意事项
1.限制性内切酶需保存于-20℃，操作时应将酶保持在冰浴中，避免长时间置于高温中。
2. 限制性内切酶溶液通常含有50%甘油，加入反应管后，因密度较大，往往沉淀至溶液底部，所以要充分摇匀。
3. 加样时吸头垂直进入试剂管，避免碰到管壁，每加完一样要换一个吸头，同时在已加的样品前做个记号以防止错加或漏加，避免污染。
4. 酶（置于冰盒上）应最后加入，尽量减少室温接触机会。加酶时吸头深入不可过深。
5. 酶解消化反应温度及时间根据该酶使用说明书而定。
6. 注意酶的用量，加入的酶量按1-3U/ug DNA计算，酶的体积应低于反应总体积
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的10%，以避免酶液中甘油干扰反应 。酶量过大（≥25U/ug DNA）时，有产生所谓星号活性的可能，即在识别序列以外的位点进行切割。此外，反应体系中甘油的质量分数大于12%，以及缺少NACL和存在M等情况下，都有可能出现星号活性。
五、相关问题
1.酶的保存
不同的限制酶往往保存在大致相似的缓冲液中，这种特定配方的缓冲液能使酶活性维持较长时间。常用的保存缓冲液各组分作用如下：
Tris-HCl （7.4―7.8）： 维持稳定的pH范围。
50-100mmol/L NaCl或KCl：提供一定的离子强度。
0.1mmol/L EDTA： 络合掉能激活限制酶的镁离子。
1mmol/L DTT： 保护酶分子上的还原性基团。
200-500ug/ml BSA： 牛血清白蛋白提高溶液中蛋白质的浓度，防止蛋白质分子浓度过低而导致酶分子变性。
50%的甘油： 使酶液保存于-20℃不至冻结。
1-5 g/L的Triton-100： 这是一种非离子型表面活性剂，能防止蛋白质分子的表面变性作用。
2. 酶单位的定义
限制酶的单位通常定义为：1U的酶能在约50ul合适的反应缓冲体系中，在1h内完成酶切1ug的λDNA。确定限制酶单位的具体操作方法是分别向1ug的底物中加入一系列的酶（1U左右），当电泳观察到酶切片段的条带不再发生变化时说明已作用完全，完全切割的最少酶量定为1U的酶量。
3. 限制酶的作用条件
限制酶切割DNA的反应中，酶切条件是实验成功的重要因素，其中包括反应的温度、时间与反应的缓冲体系，除了这些条件外，DNA的纯度与浓度也会影响酶切效果，只有在正确选择酶反应条件时才能达到最佳酶切效果。
（1）作用温度
早期的酶切反应都在37℃进行，这种方法虽然简单、统一，但却不能达到每个酶的最适反应温度。为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度。
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（2）缓冲体系
限制酶反应的缓冲体系大致相同，都含有以下组分：约100mmol/L的Tris-HCl，作用是将酶反应体系的pH维持在7.5-8.5；约10mmol/L的MgCl2，作用是为限制酶提供激活因子；1mmol/L的DTT，作用是保护还原性基团；约150mmol/L的NaCl，作用是提供合适的离子强度。由于认识的局限性，早期的限制酶反应体系仅根据其中NaCl含量的不同分为高盐、中盐与低盐三种，这同样不能使每种酶获得最适反应条件。现在提供酶的很多厂商能提供4-10种缓冲体系，其中各必需成分之间只有很小的差别，目的是使每种酶都发挥最大的作用。
缓冲液一般配成10倍的浓度，使用时以1/10的比例加入，当然为了减小吸量误差也可自行配制5倍的缓冲液。
(3) 反应体积与时间
酶反应体积一般不宜小于20ul。因为过小的反应体积在加入各种成分时易产生误差，甘油含量易超过10%。在37℃保温可因水分蒸发而明显改变反应体系中各成分的浓度，从而影响酶活力。同时还要考虑反应完毕进行电泳时，所加样品中DNA的量能够在电泳中显出清晰的泳带。
常规的酶切反应一般控制在60min内进行，但也可以根据切割对象与所用的酶将保温时间延长至十几个小时。
(4) DNA的纯度与浓度
除了上述酶反应条件外，影响酶切效果的最主要因素是DNA的纯度。例如，样品中含有大量RNA杂质时会因减少了酶的有效浓度而影响酶切效果；某些杂蛋白未除净而结合在DNA时也会影响酶切效果。。至于抽提过程中未除净的各种影响因素就更多了，可能是微量的氯仿、SDS、EDTA、酚、EB、乙醇或是琼脂糖凝胶中的硫酸根离子等。
DNA纯度的另一个指标是不可含有微量的DNA酶。如果酶切后电泳结果显示出不清晰条带或成为一片红色（术语称Smear）时，可肯定系统中已经污染了DNA酶。
DNA样品中含有大量RNA时可用RNA酶处理；含有结合在DNA上的杂蛋白与DNA酶时都可用氯仿/异戊醇抽提；当样品中含有氯仿、SDS、硫酸根等抑制酶切的小分子物质时可以通过沉淀更换一个新的缓冲体系。当然，酶切失败时也不能排除除DNA外的一切因素，如无菌水，EP管，吸咀等的干净程度以及内切酶自身的酶活性情况。
除纯度外，DNA的浓度也会影响酶切效果，一般DNA质量浓度在1ug/20ul才能得到较好的酶切效果，质量浓度高达1.5ug/20ul时就可能发生酶切困难。
(5)终止酶切反应的方法
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如果需对酶切片段进行连接或标记等操作时，首先要将限制酶灭活。灭活的方法可分为三种：第一种是向反应缓冲体系中加入终浓度为10-12.5mmol/L的EDTA，原理是络合掉酶反应中所需的镁离子。但这种方法会影响需镁离子的后续反应。所以一般加入EDTA后，要用乙醇沉淀法来更换缓冲体系，以除去EDTA，但这样就会造成DNA的损失。第二种方法是热失活：一般的酶如EcoRⅠ等在65℃保温60min即可；另一些酶如Hind Ⅲ等需在85℃保温30min方能达到目的；极端的例子是Ttb Ⅲ甚至不能用加热的方法使之失活。热失活方法的特点是简单并且未向体系中引入任何物质，特别适用于连续进行几个酶切反应；热失活法的另一个特点是不用更换体系，所以不会造成DNA的损失。第三种方法是用酚和氯仿抽提使之失活，之后以乙醇沉淀DNA片段。这种方法的特点是处理条件剧烈，能使酶彻底失活（不像第一种方法中酶蛋白并未变性而只是没有激活因子而已）。
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实验五 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
一、实验原理
体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。宿主细胞一般是限制―修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂
1. 仪器：
恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料
E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：
LB培养液（1L）：
胰蛋白胨 10g
酵母粉 5g
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分子生物学实验室常用仪器及使用方法
