蛋白质的定量分析方法

蛋白质的定量分析方法

1． 蛋白质的常规检测方法

1.1 凯氏定氮法

一种最经典的蛋白质检测方法。原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好。缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大。 1.2 双缩脲法

常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。原理：双缩脲是三分子的脲经180℃左右加热，放出一份子氨后得到的产物，在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽链中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅和蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。优点：较快速、干扰物质少、不同蛋白质产生的颜色深浅相近。缺点：灵敏度差、三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。 1.3 Folin酚试剂法

原理：与双缩法大体相同，利用蛋白质中的肽键和铜离子结合产生双缩脲反应。同时也由于Folin酚试剂中的磷钼酸-磷钨酸试剂被蛋白质的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝的混合物。在一定条件下，蓝色深度与蛋白的量成正比，由此可测定蛋白质的含量。优点：灵敏度高、对水溶性的蛋白质含量的测定很有效。缺点：费时，要精确控制操作时间；Folin酚试剂的配制比较繁琐，且酚类和柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油、还原剂（二硫代苏糖醇、巯基乙醇）、EDTA和尿素均会干扰反应。 1.4 紫外吸收法

原理：蛋白质中的酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基使其在280nm处具有紫外吸收，其吸光度与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在280nm处的吸光值与肽键含量成正比。利用一定波长下蛋白质溶液的吸光值与蛋白质含量的正比关系可以测定蛋白质含量。优点：简便、灵敏、快速、不消耗样品，测定后能回收。缺点：测定蛋白质含量的精确度差、专一性差；干扰物质多，若样品中含有嘌呤、嘧啶等能吸收紫外光的物质会出现较大的干扰。 1.5 考马斯亮蓝法（Bradford法）

原理：考马斯亮蓝G250在酸性溶液中与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合（蛋白质与染料间的疏水作用也很重要），使染料最大吸收峰的位置从465nm变为595nm，溶液的颜色也有棕黑色变为蓝色，在595nm下测定的吸光度值与蛋白质溶度成正比。优点：灵敏度高，测定快速、简便，干扰物质少，不受酚类、游离氨基酸和缓冲剂、络合剂的影响，适合大量样品的测定。缺点：由于各蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸含量不同，因此用于不同蛋白质测定时有较大的偏差。

Bradford法一般注意事项：1.不要用石英杯做比色（染料会与之结合），使用玻璃或塑料为佳，使用后用甲醇或去污剂来洗掉结合的痕量染料；2.若用同一比色杯，应先测定低浓度样品避免误差；3.选择570-610nm波长；4使用不同公司生产的染料可能得到不同结果；5.使用高质量试剂和水；6.要使样品浓度落在

标准曲线线性范围内；7.最好用γ球蛋白或卵清蛋白，因为BSA会比其他多数蛋白质结合多一倍的染料，所以用BSA时会低估蛋白质含量，但是测定血清蛋白时使用BSA更准确。

一般实验步骤：1.染色液配制：取100g考马斯亮蓝G250溶于50ml95％乙醇中，再与100ml85％磷酸混合，用蒸馏水补足至1L。使用Whatman1号滤纸过滤后置于棕色瓶中室温保存即可，若有沉淀产生用前应过滤。2.酶标板（96孔）测定：

取0、2、4、6、10、15、20ul的BSA标准蛋白质溶液（1mg/ml）到酶标板孔中；

取最多20ul蛋白质样品到单独孔中； 加入40ulBradford试剂到所有孔； 加水补足到200ul； 测定595nm处吸光值。 一种改良的Bradford法：

尽管Bradford法抗干扰能力较强，但是一些碱性试剂（尿素、碱性载体两性电解质）还是会影响G250与蛋白质结合。所以在加入染料之前使用酸来中和样品能够改善效果。由于有未与蛋白质结合的自由染料存在，所以测定的标准曲线不是线性的（做标准曲线要准确些）。据报道，使用595nm和450nm双波长测定可以有效解决这一问题（水做空白组），在增加准确度的同时，还能够将灵敏度提高十倍。（注意：样品中含有SDS时不使用该方法）

实验步骤：

准备阶段：染色液：按照常规配制，4℃保存；裂解液：9mol/L尿素、4％（体积分数）NP-40、20g/L的两性电解质、2％巯基乙醇；蛋白质标准品：用样品溶液（裂解液）配成5mg/L，分装-20℃冻存以保证重复性（-20℃保存6-8个月、-80℃保存1年）

实验操作： 从-20℃冰箱中取出标准品和裂解溶液，充分溶解； 标准品12000rpm,3min；样品12000rpm,20min使之澄清； 新鲜配制0.1mol/LHCI（10ul/管）并加入纯水（80ul每管）； 按下表数值分别配好标准品、样品溶液，轻轻混匀（振荡仪）： 标品含量ug 5 10 15 20 25 30 40 50 标品体积ul 1 2 3 4 5 6 8 10 样品体积ul 9 8 7 6 5 4 2 0 盐酸ul 10 10 10 10 10 10 10 10 水ul 80 80 80 80 80 80 80 80 过滤染色液后每管加取3.5ml，用振荡器轻微摇匀5min； 595nm检测。用一次性比色杯（反应5min可充分显色，但10-15min沉淀开始出现，尤其高溶度蛋白在酸性条件下易产生沉淀）；

做标准曲线计算分析。

2． 蛋白质的电化学检测方法

2.1 蛋白芯片技术

原理：将各种蛋白质固定于载玻片等各种载体介质上成为检测的芯片，然后用标记特定荧光物质的抗体与芯片上的蛋白质相匹配结合，抗体上的荧光将指示对应蛋白质及其表达数量。优点：快速、低成本

2.2 电化学免疫传感器

原理：电化学免疫传感器是基于抗体抗原反应，可进行特异性定量分析的自给式的集成器件，抗体、抗原是分子识别原件且与电化学传感元件直接接触，并通过传感元件把某种化学物质浓度信号转变为相应的电信号。

3． 蛋白质的分子生物学检测方法

3.1 邻位连接技术

3.2 核酸适体

3.3 电泳法

3.4 二甲酸奎林（BCA)法

最初由Smith等建立，同Lowry法类似，也是在碱性条件下有铜离子被还原形成亚铜离子（还原剂、金属离子螯合剂会产生干扰），亚铜离子通过与BCA反应而被检测，。

Lowry法和BCA法灵敏度相似，但是BCA法在碱性条件下稳定，可以一步完成反应且抗干扰能力强，形成的深紫色反应产物最大吸收波长是562nm，在一定条件下，此复合物吸光度与蛋白质浓度成正比。

优点：购买方便、检测速度快、灵敏度高、对大多数表面活性剂不敏感；且由于反应在碱性条件下进行，故绝大多数蛋白质保持在溶解状态。

缺点：对还原剂、金属离子螯合剂等很敏感，在裂解液中对该方法干扰最大的成分是DTT，测定时样品需要充分稀释。

标准方法（0.1-1mg/ml样品）： 试剂A（100ml）：BCA-Na2 1g、Na2CO3?H2O 2g、C4H4O6Na2?2H2O 0.16g、NaOH 0.4g、NaHCO3 0.95g，用少量的固体NaHCO3或50％NaOH溶液调节pH至11.25；

试剂B（20ml）：CuSO4?5H2O 0.8g；

工作液配制：试剂A：试剂B=50：1（体积比）混合，该苹果绿溶液可室温

稳定一周；试剂A、试剂B在室温下很稳定，可以长期存放；

取100ul含有10-100ug蛋白质的样品溶液加入2ml工作液，60℃孵育30min； 冷却至室温测定562nm(595nm)处吸光度；

使用1mg/ml的BSA蛋白质标准液稀释作标准曲线。 具体实验操作步骤：

1. （将蛋白质样品从-20℃转移至4℃溶解待用）计算工作液配置量=（样品数+8+1）×200ul=C ml

2. 样品稀释与浓缩：实验用BSA溶液为2mg/ml，而样品样品测定时浓度应稀释或浓缩至标准曲线限行范围内（以最终OD值落在标准曲线中值为优）。

稀释：样品浓度过高时需进行稀释，根据要求用双蒸水稀释相应倍数，操作在向酶标板孔中加样时体现；

浓缩：样品浓度过低时需进行浓缩，a.将超滤管固定在EP管内，加入400ul样品，11000rpm、5min，转移EP管底废液；b.以离心结果（超滤管内剩余液面高低）加样品溶液进行二次、三次....离心至样品完全浓缩（最后一次离心留取400ul左右溶液与超滤管内）；c.将超滤管内液体进行反复抽打后转移至EP管内。

3. 按下表将各溶液、试剂加取至酶标板孔内： 1 2 3 4 5 6 7 8 样品 ddH2O 0 5 10 15 17.5 19 19.5 20 a BSA(2mg/ml) 20 15 10 5 2.5 1 0.5 0 b 工作液 200 200 200 200 200 200 200 200 200 单位：ul a+b=20；a、b值根据稀释倍数而定。

4. 振荡仪振荡5min，37℃水浴30min，用干净的细针头扎去大气泡； 5. 打开软件设定程序和参数，将酶标仪扳进仪器内进行测定595nm处吸光值，导出数据进行计算。

4． 免疫法

4.1 免疫扩散法

蛋白质定量的一般注意事项：

1. 采用同标准曲线比较的方法只能用来确定与标准蛋白浓度相近、性质类似的蛋白质样品；

2. 定量时一定要是样品浓度在标准曲线限行范围内； 3. 使用溶解蛋白质样品的溶液来溶解标准蛋白；

4. 蛋白质电泳前精确定量目的：保证不同样品之间的可比性以及电泳所适合的上样量；

5. 标准蛋白应尽量选择与所测定的大多数蛋白质性质更接近的蛋白质（例如：测定免疫球蛋白——IgG做标准；测定血清蛋白——BSA），常用的标准蛋白有γ球蛋白和BSA。

6. 蛋白质定量方法的选用(BCA法和Bradford法)

6.1 Bradford法特点：

a.灵敏度高（与Lowry法相比）；

b.测定快速简便，且只需加一种试剂（5分钟）； c.干扰物质少；

d.蛋白质中精氨酸和芳香族氨基酸含量不同，因此该方法用于不同蛋白质样品测定时有较大差异；

e.相关干扰物：去污剂、X-100、SDS、NaOH等； f.做标准曲线时 轻微非线性（0-1000ug/ml较好）。 6.2 BCA法特点： a.灵敏度高；

b.不受大部分样品中去污剂等的影响，可兼容5％SDS、5％X-100；5％ Tween20,60,80；

c.20-2000ug/ml有良好的线性关系；

d.检测不同蛋白质分子的变异系数还远小于Bradford法；

e.该方法收到螯合剂和略高浓度还原剂影响（EDTA小于10mM、DTT（或者巯基乙醇小于1mM）。