实验三 α-淀粉酶动力学常数的测定
一、实验背景及目的
α-淀粉酶，系统名称1,4-α-D-葡聚糖葡聚糖水解酶，别名为液化型淀粉酶、液化酶、α-1，4-糊精酶，可以水解淀粉内部的α-1,4-糖苷键，水解产物为糊精、低聚糖和单糖。
在酶促反应动力学中，以最简单的无别构中心的酶（后称米氏酶）展开合理分析，建立
【1】
米氏公式，由米氏公式得到了与酶本质相关的两个最重要的动力学常数Km 和 Vmax。
对α-淀粉酶水解淀粉的测定，可通过生成麦芽糖的浓度来确定α-淀粉酶的最大反应速度和米式常数Km的值。进而了解米式常数在动力学研究的意义，了解Km和Vmax的常用测
【2】
定方法以及原理，利用双倒数作图法学习掌握α-淀粉酶米式常数和Vmax的测定步骤。
二、实验原理
当底物浓度在较低浓度增加时，酶促反应速度随着底物浓度的增加而迅速增加。当底物增至一定浓度后，即使再增加其浓度，反应速度也不会增加很快。这是由于酶浓度限制了所形成的中间络合物浓度的缘故，这时反应速度与底物的浓度无关，是零级反应。
【3】【4】【6】【7】
米氏方程的推导:
K1([Et]-[ES])[S]=K2[ES]+K3[ES] 整理得:
（2）令：
（米氏常数）
则（2）变为([Et]-[ES])[S]=Km[ES] 整理得： 将（3）代入（1）得
（3）
（4）
当底物浓度很高，将酶的活性中心全部饱和时，即[Et]=[ES]，反应达到最大速度 Vmax=K3[ES]=K3[Et] （5） 将（5）代入（4）得米氏方程式： Km值的推导：
当反应速度为最大反应速度一半时
得 Km=[S]
[11]
Km值的含义：
① Km是酶的特征性常数之一，与酶的性质有关，与酶的浓度无关 ② Km可近似表示酶对底物的亲和力
③ 同一酶对于不同底物有不同的Km值，可判断最适底物浓度。
【9】【10】【11】【12】
Km值与Vmax值的测定：
三、实验材料、仪器和试剂
1.仪器：722型可见光分光光度计、恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）、沸
水浴锅、微量移液器 2.试剂：（1）4 U/ml的α-淀粉酶溶液（2）pH 5.0柠檬酸缓冲液（3）1%淀粉溶液（4）1 mg/ml麦芽糖溶液（5）0.4M NaOH溶液（6）3，5-二硝基水杨酸 四、实验步骤：
取13支平口试管，按下表进行操作：
表1.不同底物浓度下的酶促反应体系制作
试管 对照 1 1%淀粉（ml） 0 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0.4 0.45 0.5 0.55 0.6 0.7 0.8 1.0 1.2 1.6 2.2 3 2.6 2.55 2.5 2.45 2.4 2.3 2.2 2.0 1.8 1.4 0.8 0 柠檬酸缓3 冲液（ml） 40℃温浴10分钟，4 U/ml的酶液同时温浴10分钟。（酶液需现用现配） 各管再次混匀后，各加入1 ml温浴后的酶液，混匀并同时准确计时5 min，各管加入4 ml 0.4 M NaOH终止酶促反应。 从以上各酶促反应管中分别取1 ml置于15 ml刻度试管中，加3,5-二硝基水杨酸各1 ml，沸水浴5 min，冷却定容至15 ml，测定520 nm下的OD值。 取7支15 ml刻度试管，按下表进行操作：
表2.标准曲线制作 管号 蒸馏水（ml） 1 1 2 0.1 0.9 3 0.3 0.7 4 0.5 0.5 5 0.7 0.3 6 0.9 0.1 7 1 0 1mg/ml麦芽糖（ml） 0 以上各管混匀后，各加入1 ml3,5-二硝基水杨酸，沸水浴5 min，冷却定容至15 ml。 测定520 nm下的OD值。 五、数据整理及结果计算
表3.标准曲线OD520 管号 麦芽糖浓度（mg/ml） OD520
1 0 2 0.1 3 0.3 4 0.5 5 0.7 6 0.9 7 1 0.000 0.025 0.137 0.281 0.410 0.511 0.574 0.700 OD520 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 -0.100 0 0.2 0.4 y = 0.5679x R2 = 0.9927 0.6 0.8 1 1.2 麦芽糖浓度（mg/ml） 图1.标准曲线OD520
表4.不同浓度底物对应OD520值 管号 对照 1 2 3 4 5 OD520 0.000 0.198 0.211 0.239 0.252 0.273 6 0.323 7 8 9 10 11 12 0.332 0.375 0.439 0.476 0.569 0.683
由标准曲线：y=0.5679x，即A=0.5679C（其中A为吸光度，C为麦芽糖浓度）
将不同浓度底物OD值代入其中得对应麦芽糖浓度C。 V=C*2 ml/5 min，[S]=淀粉取液量*10 (mg/ml)/4 ml，再分别取倒数1/[S]作为横坐标，1/V作为纵坐标作图。
表5.不同浓度底物数据汇总
试管 C麦芽糖浓度（mg/ml） [S](mg/ml) V(ml/min) 1/[S](ml/mg) 试管 C麦芽糖浓度（mg/ml） [S](mg/ml) V(ml/min) 对照 0.000 0.000 0.000 7 0.585 2.000 0.234 1 0.349 1.000 0.140 1.000 7.163 8 0.660 2.500 0.264 2 0.372 1.125 0.149 0.889 6.720 9 0.773 3.000 0.309 3 0.421 1.250 0.168 0.800 5.938 10 0.838 4.000 0.335 4 0.444 1.375 0.178 0.727 5.631 11 1.002 5.500 0.401 5 0.481 1.500 0.192 0.667 5.198 12 1.203 7.500 0.481 6 0.569 1.750 0.228 0.571 4.394 1/[V](min/ml) 1/[S](ml/mg) 0.500 0.400 3.788 8 0.333 3.234 0.250 2.983 0.182 2.495 0.133 2.078 1/[V](min/ml) 4.274 1/[V](min/ml) 7 6 5 4 3 2 1 0 y = 5.7931x + 1.3765 R2 = 0.9941 -0.6 -0.4 -0.2 -1 -2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1/[S](ml/mg) 图2.双倒数作图法求Vmax，Km
结果计算：计算此α-淀粉酶的Vmax，Km 由图可知：y=5.7931x+1.3765
令x=0，得1/Vmax=1.3765 min/ml，Vmax=0.7265 ml/min 令y=0，得1/Km=0.2376 ml/mg，Km=4.2086 mg/ml 六、结果分析及结论
① 稀释后的消光值在0.2-0.8之间，符合朗伯-比尔定律，在分光计适合的量程内，
测量准确；
② 双倒数作图法避免了V-[S]作图法的数据不直观，难以求解的缺点； ③ 1/[S]的间隔较为均匀，作图合理。
22
④ 标准曲线R=0.9927，线性关系可靠，数据合理；双倒数曲线R=0.9941，线性关系
[3][4][7]
可靠，数据合理。
结论：本实验中α-淀粉酶的米Km值为4.2086 mg/ml，最大反应速率为0.7265ml/min.
-32[1]
通过查阅文献资料得α-淀粉酶的Km值为10-10mmol/L，Km值在此范围内，数据可信。 七、思考题:
1、底物浓度的计算体系应该是多少？为什么？ 答：[S]=淀粉取液量*10 (mg/ml)/4 ml。 因为1%的淀粉浓度是10 mg/ml，[S]=质量（mg）/体积（ml）=淀粉取液量*10 (mg/ml)/{3 ml(淀
粉体积+柠檬酸缓冲液体积)+1 ml（酶液体积）}。 2、实验设计的底物浓度间隔为何不是等距的？
[4]
答：①尽量保证1/[S]间隔是等距的；
②设置不等距的底物浓度，既可以观察到OD520值在间隔大时快速增长，又可以观察到OD值在间隔小时缓慢增长，使实验结果更具普遍性和参考价值。
[1][12]
3、本实验在操作策略上你认为最要注意什么，才能保证实验结果的可用？ 答：①保证向试管中加入酶液和NaOH的时间间隔一致；
②酶促反应时间确保准确计时5 min；
③移液枪使用的正确性：取液时按到第一个档位，加液时按到第二个档位。 八、总结
本次实验通过测量α-淀粉酶动力学常数，掌握了双倒数曲线作图，进一步加深了对米
[8][9]
氏常数的理解。在实验过程中，要保证向试管中加入酶液和NaOH的时间间隔一致；酶促反应时间确保准确计时5 min。否则会导致实验数据不准确，计算结果差距较大。本实验是一个非常讲究配合的实验，所以在实验前应该充分讨论怎样的操作策略才能获得基本可用的实验结果。 九、参考文献
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α-淀粉酶动力学常数的测定
