95%乙醇 1~2小时 95%乙醇 1~2小时 100%乙醇Ⅰ 1小时 100%乙醇Ⅱ 1小时 （2）丙酮脱水
如果是丙酮固定的组织，则不必再经过乙醇，可以用新丙酮更换一次，便直接浸入二甲苯或苯中透明。其他水溶液固定的组织，均按上述乙醇脱水方法脱水，亦可由100%乙醇中移入丙酮继续脱水2~4小时再入二甲苯透明，透明后浸蜡包埋。 （3）正丁醇脱水
组织用正丁醇脱水前，先经50%乙醇脱水，然后移入正丁醇和乙醇混合液进行脱水。 50%乙醇 6~12小时 50%乙醇+20%正丁醇+30%蒸馏水 5~8小时 50%乙醇+35%正丁醇+15%蒸馏水 4~6小时 45%乙醇+45%正丁醇+10%蒸馏水 3~5小时 25%乙醇+75%正丁醇 2~3小时 25%乙醇+75%正丁醇 1~2小时 15%乙醇+85%正丁醇 1~2小时 5%乙醇+95%正丁醇 1~2小时 100%正丁醇Ⅰ 1小时 100%正丁醇Ⅱ 1小时 4．注意事项：
（1）脱水的过程应逐步地而不应骤然地进行，不能操之过急。 （2）脱水的时间应根据组织块的大小和组织的类型而定。
（3）组织块在高浓度，特别是无水乙醇内不能放置的时间太长。无水乙醇吸水能力太强，容易造成组织块的过度硬化，使得切片理组织易碎裂。 （4）在脱水的过程中可以将组织块停留在70%~80%的酒精中。
（5）每次更换新的脱水剂时（组织块从低浓度到高浓度），都要把组织块放在吸水纸上吸干，装组织块的容器也要控干水分，以免将水及低浓度脱水剂带入高浓度脱水剂中，影响脱水效果。
（6）脱水剂的先择要根据实验的要求及实验室的条件 （二）透明 1．透明的目的
置换组织内的脱水剂，为下一步的浸蜡起到桥梁作用； 使组织呈现不同程度的透明状态，有利于光线的透过。 2．透明剂
（1）二甲苯：是现在应用最广的一种透明剂，价格较便宜，不能和水混合，遇水则变成乳白色浑浊，因此必完全脱水后才能使用；易溶于酒精又能溶解石蜡，透明力强；其最大的缺
点是容易使组织收缩变硬变脆，所以组织不能在其停留过久，透明时间视组织块的大小、性质而定；有的组织如肌肉、肌腱、软骨、骨、皮肤、头皮及眼球等，不宜用二甲苯透明，因组织过硬不易切片；长时间接触，对粘膜有刺激作用。
（2）苯：性质与二甲苯相似，对组织收缩也较小，组织也不易变脆，但透明较慢，组织在其内可以滞留12~24小时，但毒性较大。
（3）香柏油：用为透明剂，效果很好，有高度透明作用，能与醇和二甲苯混合，香柏油对组织的硬化及收缩程度比任何其他透明剂都要小，但透明的速度较慢，3mm以下厚度的组织块需12小时以上。香柏油与石蜡不易融合，即香柏油不易被石蜡取代，因此经香柏油透明以后，可经过二甲苯短时间媒浸，再进行石蜡包埋。肌肉、皮肤、血管、膀胱、垂体及肾上腺等用香柏油效果较好。 3．二甲苯的步骤：两次透明 第一次透明约40分钟
第二次时间不一定，要视透明效果而定 4．注意事项
（1）时间不宜过长，否则组织会变脆； （2）组织块脱水必彻底。 （三）浸蜡、包埋（石蜡包埋法） 1．浸蜡 （1）浸蜡的目的
置换组织中的透明剂，为包埋做准备。 （2）浸蜡的步骤
在60度恒温蜡箱中放置3个蜡杯，分别编号1（52℃~54℃）、2（52℃~54℃，或54℃~56℃）、3（56℃~58℃），其中分别盛软蜡、软蜡、硬蜡，取透明好的组织块放入软蜡中各1小时，迅速取出放入硬蜡，同样放置1小时。如果时间来及包埋，可以将已经完成浸蜡的组织块取出放在温箱外，第二天继续。 （3）注意事项
温箱中的温度必须严格控制在60℃的范围，不能超过60℃；浸蜡时间不宜过长。浸蜡温度过高或时间过长使组织收缩过度收缩和脆变。 2．包埋 （1）步骤
①准备包埋蜡：一般应用硬蜡（56~58℃或60~62℃）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性，可以加一些蜂蜡。蜡的熔点应与组织的硬度相适应。包埋用过的石蜡可以反复使用。
②准备包埋框：可以用金属的，也可以用硬纸摺叠。 ③点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子，需作标记应先写好标签。
④在金属框中倒入硬蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。可室温下冷却。 ⑤包埋框或纸盒内的蜡逐渐凝结，若表面已凝结形成一层固体状，即可放入冷水中，加速其
凝固。
⑥待蜡块完全凝固以后，便可拆卸包埋框架， 或拆开纸盒，取出蜡块。 （2）注意事项
①包埋时夹取组织的镊子，用酒精灯随时烧热，以免石蜡凝结后粘附在镊子上，造成蜡块凝固不均匀。
②包埋操作要迅速，组织从浸蜡杯中取出置入包埋框中的时间应尽量缩短。
③包埋后的蜡块应呈均质半透明状，如果出现白色混浊状，一般出现在组织周围或组织的底部，应考虑这样几个方面的问题：a. 脱水不彻底。b.包埋蜡温度低了，组织进行包埋时，包埋框中的蜡已成凝结状。c.组织内还残留有较多的透明剂，d.石蜡不纯。 ④包埋箱中的温度必须保持恒定。
⑤如包埋得不好，可将蜡块溶化，重新浸蜡和包埋。 ⑥较小的组织可在脱水透明时开始用伊红染色
六、石蜡切片制备
（一）石蜡切片前的准备
1．切片刀。传统的切片刀在使用之前，一定要在显微镜下检查刀口的损伤程度，然后进行磨刀。现在也可以使用一次性刀片，可省去磨刀。
2．修整蜡块：切去组织周围过多的石蜡，一般情况下在组织周围留有约1~2mm的石蜡边，两边必须平行。
3．蜡块固定：修整好的蜡块先固定在事先准备好的小方木块或者金属块上，固定方法是把蜡铲先在酒精灯上加热，再将蜡块底部烙熔，迅速烙粘在小方木块或金属块底座上。 4．载玻片擦洗干净后，在其表面涂上粘附剂（蛋白甘油、APES或多聚赖氨酸），根据染色方法选择不同的粘附剂。 5．准备好毛笔、镊子、染色架。
6．调好展片器内水的温度（45℃），有时也可以加些酒精到水中。 （二）石蜡切片
1．将切片刀装在刀片机的刀架上并固定紧，固定蜡块底座或蜡块，调整蜡块与刀至合适位置，刀刃与蜡块表面呈5度角。
2．切片多使用轮转式切片机，切片时，左手执毛笔，右手转切片机转轮，先修出组织块。 3．调整切片机上的切片厚度为4~7μm，然后切片。 4．切片可以是单张，也可以是连续切片形成蜡带 5．展片和捞片：
（1）直接展片法：在载玻片上滴加几滴蒸馏水，然后把切片铺在小滴上面，用酒精灯在载玻片下面加热，待完全展平，倾斜载玻片，倒弃多余水分，同时摆正切片。
（2）温水漂浮法：此法用展片机或者用恒温水浴箱，先使水温保持在45~50℃，用左手拿毛笔轻轻托起切片，用右手用眼科镊子夹起切片的一角，正面向上轻轻平铺放置于展片器的
水面上，动作要轻快，切好的石蜡切片漂浮在温水中受热后及在表面张力的作用会自然平整地展开，必要时可用眼科镊轻轻拔开，然后捞片，并及时编号。
6．展好的切片在室温下稍微干燥后，放在40℃恒温烤箱中，小片组织30分钟即可，大的需12~24小时，烤干备用。 （三）注意事项
1．切片刀刃倾斜过大或过小都不能正常进行切片。
2．修整蜡块时要细心，看清楚组织在蜡块中的位置，以免将需要的组织修掉。 3．连续转动切片机的转轮时，速度一定要均匀，不能时快时慢，以免切片厚薄不一。 4．使用轮转式切片机切片时，是由下向上切，为得到定然整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬、脆难切的部分放在上端，如皮肤应将表皮部分向上，肠胃等组织应将浆膜面面朝上。
5．用展片器展片时，水温应根据使用的石蜡熔点进行了调整，一般低于石蜡熔点10~15℃；捞片的时候动作要轻、稍快。动作太大容易出现气泡。如果没有展片器可以用温水浴锅来代替。
6．单个切片要摆到载玻片的1/3与2/3交界处；连续切片的粘片顺序一般是从左到右，组织切片较小是，可以并列粘贴2~3条蜡带。
7．烤片的温度不宜过高；烤片的时间要合适。脑组织要待稍微晾干一些后，才能烤片，否则容易产生气泡影响染色和观察。
七、H-E染色
（一）步骤 1．脱蜡
二甲苯I 10分钟 二甲苯II 5分钟 2．水化
100%酒精I 5分钟 100%酒精II 5分钟 95%酒精I 5分钟 95%酒精II 5分钟 85%酒精 3分钟 75%酒精 2分钟 蒸馏水冲洗 1分钟 3．染色
苏木精染色 5分钟 自来水洗
盐酸酒精分化 15秒
自来水洗（镜检）
自来水洗 15分钟 蒸馏水洗 2分钟 75%酒精 2分钟 85%酒精 2分钟 0.5%伊红染色 1分钟 95%酒精I 5分钟 95%酒精II 5分钟 100%酒精I 5分钟 100%酒精II 5分钟 二甲苯I 5分钟 二甲苯II 5分钟 4．封片 中性树胶封片
上述处理好的玻片，取中性树胶滴入载玻片的组织上，取盖玻片从一端逐步盖下去，避免发生气泡 （二）注意事项
1．染色之前一定要了解清楚所用的染色液的配制方法，不同的染色液染色后的处理是不一样的。
2．染色过程中所用的时间要根据染色时的室内温度、染液的新鲜程度及实验室的实际情况等灵活掌握。在室温高、切片、染色液又是新配制的，染色时间就要短，反之时间就长。 3．伊红有水溶的和醇溶的，如果用的是水溶的，应该在脱水前进行染色，如果是醇溶的，应使用与溶解伊红等浓度的酒精开始脱水。
4．在二甲苯脱蜡之前可以先在60℃烤箱内0.5~1小时，这样可以使切片粘附更牢固不易脱片，也有利于脱蜡。
5．二甲苯在HE染色中有脱蜡、透明的作用。二甲苯脱蜡的好坏主要取决于切片在二甲苯内放置的时间和脱蜡时的温度以及二甲苯的使用次数。染好的切片必须经过透明，有利于显微镜观察，同时并为封片起到了桥梁作用。
6．用梯度酒精脱水时，在低浓度酒精中时间不宜过长，到高浓度时逐步延长脱水时间。以免脱水不彻底，影响二甲苯透明的效果。
7．在酸性分化液内停留的时间不要过长，分化不可过度，避免使细胞核内该染上色的结构脱色。不需分化处理的苏木精染色时要注意掌握染色时间，以防止组织切片染色背景过深或细胞核、胞质染色不足。
石蜡切片制备基本步骤（附HE染色步骤）
