第六章 FlowJo分析细胞凋亡样本
一、细胞凋亡概述
细胞凋亡又称细胞程序性死亡，有别于细胞坏死。细胞凋亡是指在一定的生理病理情况下机体为维护内环境的稳定，通过基因调控，在一系列酶的参与下，使生物体内一些无用的、老化的细胞高度有序的自动死亡过程。Annexin V-FITC/PI双标记法检测细胞的凋亡是实验室常用的一种方法。 Annexin V-FITC/PI双标法染色的原理：
磷脂酰丝氨酸（PS）能与连接素V（Annexin V-FITC）发生特异性结合。正常的活细胞带负电磷脂酰丝氨酸（PS）位于细胞膜的内侧。细胞凋亡发生时，由于细胞膜磷脂对称性的改变而使PS外翻暴露于细胞膜外。PI为核酸荧光染料，不能穿透正常细胞的细胞膜，只能进入细胞膜损坏的细胞。凋亡细胞因为PS外翻从而可以和Annexin结合，但是保持了细胞膜的完整性，不能与PI结合。当细胞凋亡晚期或发生继发性坏死时，细胞膜破坏，可以同时被Annexin V-FITC/PI着色。所以如果是Annexin单阳性的细胞的话，就是凋亡早期细胞，如果Annexin, PI 双阳性的话，即是坏死细胞。如下图所示：
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二、FlowJo分析凋亡数据的过程
演示数据：“apoptosis”文件夹中的ZL-2011-12-20_400.fcs
1. 把凋亡样本拖入FlowJo，双击原始数据打开图形窗口。
X轴选择FSC-A,Y轴选择SSC-A。分析凋亡的细胞选择上图所示的细胞群体进行分析。细胞碎片不予分析。如下图所示：
2. 在SSC/FSC图中双击“分析的细胞群体”，
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X轴选择FITC,用来表示AnnexinV-FITC。Y轴选择PE-Texas,用来表示PI。用四分门设门工具界定活细胞和凋亡细胞。如下图所示：
三、凋亡数据结果分析
1. 用四分门设门的原则：四分门设门要根据阴性对照界定阴性区。根据细胞分
群的趋势，四分门的界定线可设在阴性、阳性细胞的分群处 2. 上图中各个区域的含义：
Q1：(AnnexinV-FITC)-/PI+，此区域的细胞为坏死细胞。也可能有少数的晚
期凋亡细胞在其中，甚至机械损伤的细胞也包含其中。 Q2: (AnnexinV+FITC)+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。 Q3：(AnnexinV-FITC)+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。 Q4：(AnnexinV-FITC)-/PI-，此区域的细胞为活细胞。
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通常统计细胞凋亡率时采用Q2+Q3，晚期凋亡＋早期凋亡群（即所有AnnexinV阳性群）。
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第七章 FlowJo软件分析细胞周期样本
一、细胞周期分析概述
细胞周期的检测是流式细胞仪最为广泛的应用之一。细胞周期是指以有丝分裂方式增殖的细胞从亲代分裂结束到子细胞分裂结束所经历的过程。通常由G1期、S期、G2期和M期组成。细胞在G1期完成必要的生长和物质准备，在S期完成染色体DNA的复制，在G2期进行必要的检查和修复，以保证DNA复制的准确性。在M期完成遗传到子细胞中的均等分配，使细胞进行分裂。 细胞周期检测的原理：
核酸染料可以与DNA分子特异性的结合，细胞周期检测中PI最为常用。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。如下图所示：
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