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病毒感染细胞实验整体流程及原理
目的基因不能直接整合到大多数真核细胞，常用的手段是将目的基因包装成病毒来感染细胞，从而得到表达满足实验需求。
1、病毒的种类
病毒有很多种，常见的有慢病毒和腺病毒 1.1慢病毒 1.1.1原理
慢病毒（Lentivirus）是逆转录病毒的一种。构建的siRNA/miRNA慢病毒载体，与化学合成的siRNA和基于瞬时表达载体构建的普通siRNA载体相比，一方面可以扩增替代瞬时表达载体使用，另一方面，Lentivirus-siRNA克隆经过慢病毒包装系统包装后，可用于感染依靠传统转染试剂难于转染的细胞系如原代细胞、悬浮细胞和处于非分裂状态的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组，进行长时间的稳定表达。 1.1.2特点
1）直接包装成为假病毒颗粒，对分裂和非分裂细胞均有感染作用，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞(比如神经元细胞、干细胞或其它原代细胞)。?
2）可以通过简单方式，在短时间内获得稳定表达特定基因的多
种细胞株。
3）可用于基因敲除、基因治疗和转基因动物研究。 4）无需任何转染试剂，操作简便。 5）可以根据客户需要制备多种标记。 1.1.3慢病毒包装简要流程：
1）含有目的基因的慢病毒RNAi干扰载体的构建和质粒纯化提取。
2）慢病毒载体，包装系统共转染病毒包装细胞293T等。 3）培养48hrs-72hrs左右，收集含有病毒的上清培养液。 4）病毒的纯化和浓缩。 5）分装、-80 ℃保存。
6）滴度测定目的基因检定，并出具检测报告。 1.2、腺病毒 1.2.1原理
腺病毒(Adenovirus，Ad)是一种无包膜的线状双链DNA病毒，其复制不依赖于宿主细胞的分裂。有近50个血清型，大多数Ad载体都是基于血清型2和5，通过转基因的方式取代E1和E3基因，降低病毒的复制能力。这些重组病毒仅在高水平表达E1和E3基因的细胞中复制，因此是一种适用于治疗的高效控制系统。 1.2.2特点
1）几乎可以感染所有类型的细胞
2）可以获得复制缺陷型(E1和E3缺失)的腺病毒
3）病毒滴度高，产生病毒经过浓缩后可以达到1012PFU/mL，能有效的进行增殖。
4）腺病毒载体感染宿主的范围比较广，制备容易，操作简单. 5）感染细胞时，不整合到染色体中，不存在激活致癌基因或插入突变等危险，生物安全性高。 1.2.3腺病毒包装简要流程
1）构建表达siRNA/miRNA的腺病毒载体 2）采用PacI消化纯化的质粒。
3）消化好的腺病毒表达载体转染293A细胞，收获细胞以制备病毒粗提液。
4）将病毒粗提液感染293A细胞以扩增病毒。 5）分装，-80℃保存。 1.3、慢病毒和腺病毒的比较
慢病毒载体系统和腺病毒载体系统比较 病毒表达系统 病毒基因组 复制 自主复制 自主复制 病毒基因组游离于宿主基慢病毒表达系统（Lentivirus） RNA病毒 腺病毒表达系统（Adenovirus） 双链DNA病毒 是否整合 病毒基因组整合于宿主基因组，长时间、稳定表达外因组外，瞬时表达外源基因 源基因 感染细胞类型 感染分裂和不分裂细胞，适用于难转染的原代细胞（如神经细胞）及体内实验 表达风度 表达时间 滴度 中水平表达 慢（1-3天） 滴度最高可达10*8pfU/ml 高水平表达 快（1-2天） 滴度最高可达10*11pfU/ml 克隆容量 可插入不超过8kb的外源可插入高达8kb的外源片感染分裂和不分裂细胞 片段，滴度随插入片段长度段，滴度随插入片段长度增增加而降低 免疫原性 低免疫原性 加而降低 高免疫原性 2、构建目的基因到载体
2.1构建手段
一般是根据原始质粒信息确定克隆方案，有以下两种手段。 1）如果原始质粒与载体有匹配酶切位点，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到载体，酶切，并测序鉴定
2）如果没有匹配的酶切位点，则设计带有特殊接头的引物进行PCR扩增，得到目的片段，采用相应的内切酶切下相应片段，回收并连接到穿梭载体，酶切，并测序鉴定 2.2质粒载体 2.2.1概念
能够进行自主复制的环状DNA双链结构，包括真核生物的细胞器（主要指线粒体和叶绿体）中和细菌细胞拟核区以外的环状脱氧核糖核酸(DNA)分子 2.2.2特征
质粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四环素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些质粒称为附加体(episome)，这类质粒能够整合进真菌的染色体，也能从整合位置上切离下来成为游离于染色体外的DNA分子。质粒在宿主细胞体内外都可复制。通过个些特性，人们可以把一些目的DNA片断构建在质粒中，通过转化入大肠杆菌中，利用选择培养基来筛选从而不断的复制，来得到目的产物。
病毒包装实验整体流程及原理慢病毒腺病毒
