油橄榄叶提取物橄榄苦苷的酶法水解产物及其抗氧化能力的研究
王 强1,2 王仲明1,2 谢跃杰?1,2 李园园1,2 王 波3 姚新民4 黄梅桂2,5
(重庆第二师范学院生物与化学工程学院，重庆 400067）
(重庆第二师范学院脂质资源与儿童日化品协同创新中心，重庆 400067)
(甘肃出入境检验检疫局检验检疫综合技术中心，兰州 737100)
(重庆金峡油橄榄开发有限公司，重庆 404600) (南京林业大学轻工与食品学院，南京 210037）
摘 要：评价了木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶（A. niger）、β-葡萄糖苷酶（来
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自杏仁）、半纤维素酶（A. niger）、纤维素酶等7种酶对橄榄苦苷水解程度、水解产物（橄榄苦苷元、烙醇苷元、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羟基酪醇）的影响，采用三价铁离子还原法、DPPH?体系对油橄榄叶提取物及其水解产物抗氧化活性进行研究，以VC、BHT、橄榄苦苷、羟基酪醇（对照品）等为对照。结果表明：酶法辅助提取和水解处理可以显著提高产品中橄榄苦苷元、烙醇苷元、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羟基酪醇的含量，其中，β-葡萄糖苷酶（A. niger）水解效果最佳。此外，经过酶水解后油橄榄叶提取物水解液（A. niger）的还原能力明显高于VC（2.12倍）和BHT（5.95倍），其清除DPPH?的能力也高于VC（1.29倍）和BHT（3.38倍）。结论对油橄榄叶提取物酶解制备特定水解产物的工业化生产提供了有效借鉴。
关键词：油橄榄叶；提取物；水解产物；β-葡萄糖苷酶；抗氧化能力
Assessment of enzymatic hydrolysis produces and its antioxidant activities of oleuropein in
olive leaf extracts
Wang Qiang1,2 Wang Zhongmin1,2 Xie Yuejie1,2 LI Yuanyuan1,2 Wang Bo3, Yao Xinmin4 Huang Meigui2,5 (College of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education1, Chongqing 400067 ) (Cooperative Innovation Center of Lipid Resources and Children's Daily Chemicals, Chongqing University of Education2, Chongqing 400067 )
(College of Light Industry and Food Science, Nanjing Forestry University3, Nanjing 210037)
(Gansu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau Central Laboratory of Technical Center4, Gansu 730010 ) (College of Light Industry and Food Science, Nanjing Forestry University, Nanjing 210037, China)
Abstract: The influence of seven different enzymes (papain, alkali protease, neutral protease, β-glucosidase (A.
基金项目：重庆市社会事业与民生保障科技创新专项（cstc2017shms-xdny80081），北京食品营养与人类健康高精尖创新中心开放基金（20171044）,重庆市创新创业示范团队支持计划（201618793）,重庆第二师范学院科技协同创新平台建设项目（2017XJPT01） 收稿日期：2017-12-03
作者简介：王强，男，1982年出生，副教授，抗氧化自然资源利用与生理生化 通信作者：黄梅桂，女，1983年出生，副教授，食品化学
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niger), β-glucosidase(almonds), cellulose (A. niger) and cellulase) on oleuropein hydrolysis capacity and its hydrolysis produces (oleuropein aglycon, ligstroside aglycon decarboxymethyl oleuropein aglycon, decarboxymethyl ligstroside aglycon, and hydroxytyrosol) were investigated. The antioxidant capacities were analyzed by FRAP and DPPH? compared with VC, BHT, oleuropein and hydroxytyrosol. The hydrolysis capacity of β-glucosidase from A. niger was highest and selected. Further the influence of β-glucosidase from A. niger on hydrolysis produces was analyzed. The reduce power of hydrolysis produces of olive leaf extracts was higher than VC and BHT (2.12 times and 5.95 times, respectively). The DPPH? scavenging capacity of hydrolysis produces of olive leaf extracts was higher than that of VC and BHT (1.29 times and 3.38 times, respectively). Key words: olive leaf; extracts; hydrolysis produces; β-glucosidase; antioxidant 中图分类号：S565.7 文献标志码：A 文章编号：
橄榄苦苷（oleuropein，OE）及其苷元（aglycon）是一种天然裂环烯醚萜苷类多酚化合物，广泛存在于各种木犀科的木犀榄属、丁香属、女贞属等植物中。20世纪50年代初，OE一直被认为是橄榄油中的一种苦味素；1960年，Panizzi等[1]首次从橄榄油中苦味成分中分离出OE；1970年，Inouye等[2]首次从女贞树提取并纯化了橄榄苦苷，并明确了OE结构，其结构中含有6个羟基（如图1所示），具有多种药理活性，近年来研究备受关注。
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图1橄榄苦苷、橄榄苦苷元Oleuropein aglycon、烙醇苷元Ligstroside aglycon、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷
元的基本结构
研发发现，橄榄苦苷以油橄榄及其叶中含量最高[3-5]。油橄榄（Olea europaea L.）属木犀科（Oleaceae）木犀榄属（Olea）常绿乔木，是世界著名的木本油料兼果用树种，栽培品种有较高食用价值。采用油橄榄提取橄榄苦苷及其苷元成本太高[3,4]。研究发现油橄榄叶含有的抗氧化活性成分较之橄榄油更为突出，主要有橄榄苦苷、羟基酪醇（hydroxytyrosol，HT）、黄酮类、木酚素类和咖啡酰苯乙醇苷类等多酚类化合物[3-7]；油橄榄叶提取物早已被地中海地区的人们当作民间医药来治疗发烧和其他疾病如疟疾等[8]，油橄榄叶提取物具有强的抗氧化活性和抑菌活性[9]。现代药理实验研究表明，油橄榄叶中含有丰富的活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗肿瘤和降血糖等活性，并逐渐应用于医药、保健食品、化妆品等行业且应用前景广阔[8-12]。
我国甘肃陇南、重庆奉节、四川广元等地均大力推广油橄榄种植，但均缺乏除橄榄油外其它副产物的深加工和综合利用，油橄榄叶及榨油所产生的果渣和废液不仅没有得到充分利用，还造成了环境
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污染。在油橄榄果生长过程中，会产生大量的副产物——油橄榄叶，每年每棵油橄榄树修剪过程就要产生超过25 kg的嫩枝和树叶。长期以来，对油橄榄叶的利用还很不充分。虽然国外已有将油橄榄叶提取物用于食品、药品和化妆品等行业的应用报道，国内也有一些将橄榄叶加工成茶饮料、油橄榄叶挂面等报道，但均直接利用原料叶或粗提物；对如何有效提取分离油橄榄叶中裂环烯醚萜类化合物，拓展该类化合物的应用范围，还有做大量的工作要做。油橄榄叶中橄榄苦苷的提取方法通常有酶提取法、醇浸提法、索氏抽提法、微波辅助提取法、超临界CO2萃取法等，但是均对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷及其水解产物的组成未知[13-18]。本试验通过在橄榄苦苷提取的过程中添加各种水解酶，探索水解酶对提取过程及其水解产物的影响机制，在此基础上，分析油橄榄叶提取物中橄榄苦苷及其水解产物的组成和抗氧化能力，以期对油橄榄叶有效综合利用提供一定的借鉴。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器
供试油橄榄叶：从重庆奉节县油橄榄种植基地采集（试验采用完全随机设计，选取不同株生长健壮、长势一致的生叶为试材，均为成熟叶，即非嫩叶或老叶）；
橄榄苦苷、羟基洛醇对照品(纯度≥ 98%) 成都曼思特生物科技有限公司；1,1-二苯基-2-苦基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、维生素C（VC）、2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT）、β-葡萄糖苷酶（A. niger）（100 U/mg）、β-葡萄糖苷酶（来自杏仁）（100 U/mg） 美国Sigma-Aldrich公司；半纤维素酶（A. niger）（1.5 U/mg） 北京索莱宝科技有限公司；木瓜蛋白酶（100 U/mg）、碱性蛋白酶（200 U/mg）、中性蛋白酶（100 U/mg） 诺维信（中国）生物技术有限公司；纤维素酶（45 U/mg） 阿拉丁试剂(上海)有限公司；其他化学试剂均为分析纯。
JYL-C012Joyoung/九阳料理机；高压均质机；DHG-9240A电热恒温鼓风干燥箱、DK-8D三孔电热恒温水槽、722S 型可见分光光度计；PHS-3C型pH计；KH-5200DE 型数控超声波清洗器。 1.2 方法
1.2.1 油橄榄叶处理方法
蒸馏水清洗，室内自然阴干，60 ℃干燥，粉碎过40目筛，于4 ℃保存备用。 1.2.2油橄榄叶中橄榄苦苷的提取
定量称取1.0 g油橄榄叶干燥粉末，加入40 mL甲醇水溶液（甲醇与水的比例为4:1，v/v），搅拌群均匀后，置于超声波清洗器中超声提取24 h；冷却至室温，离心（1500×g，15 min），取上清液，过0.45 μm滤膜，计算油橄榄叶中橄榄苦苷提取率[15]。 1.2.3酶法水解
选取木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶（A. niger）、β-葡萄糖苷酶（来自杏仁）、半纤维素酶（A. niger）、纤维素酶等7种酶，称取相同酶活力（1.5 U/mg）的各种酶均在最适温度和pH条件下进行酶解实验（即将上述酶分别加入“1.2.2”实验过程中）。分别于1、2、4、6、8、10、12 h将酶解体系放置于–20℃条件下终止酶解反应，分析各酶解阶段的酶解率及产物组成。
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酶解率（%）=（m橄榄苦苷水解前–m橄榄苦苷水解后）÷m橄榄苦苷水解前×100% 1.2.4 LC–MS/MS产物组成分析
色谱条件：色谱柱为UPLC BEH C18（50 mm × 1.0 mm, 1.7 μm）；流动相：A为0.2 %（v/v）甲酸乙腈， B为0.2 %（v/v）甲酸水；流速0.15 mL/min；进样量：2.0 μL；柱温35 ℃。质谱条件：采用电喷雾离子源（ESI），在负离子电离模式下选用MRM扫描方式进行质谱测定；毛细管电压4 kV，喷雾压力5 kV，辅助加热气：氮气，流量 8 L/min；加热温度：300 ℃；其他质谱条件见表1。
表1 LC-MS/MS分析橄榄苦苷水解产物的定性和定量参数
成分 橄榄苦苷
橄榄苦苷元Oleuropein aglycon 烙醇苷元Ligstroside aglycon 去(羧基甲基)橄榄苦苷元 去(羧基甲基)烙醇苷元
羟基酪醇
前体离子(m/z)
539.2 377.1 361.1 319.1 303.1 153.0
定量离子对(m/z) 539.2→307.1 377.1→275.1 361.1→291.1 319.1→59.0 303.1→59.1 153.0→123.0
目标产物离子(m/z)
275.0 307.0 259.0 123.0 137.0 108.0
1.2.5油橄榄叶提取物水解前后的抗氧化能力的半数抑制质量浓度（IC50）测定
1.2.5.1 铁离子还原法（FRAP） 参考Benzie等报道的方法[20]。取100 μL提取物，加1.8 mL TPTZ工作液[由0.3 mol/L醋酸盐缓冲液25 mL（pH 3.6），10 mmol/L TPTZ溶液2.5 mL，20 mmol/L FeCl3溶液2.5 mL组成]，混匀后37 ℃反应15 min，测定吸光度A593 nm，以1.0 mmol/L FeSO4为标准，样品抗氧化活性以达到同样吸光度所需的FeSO4的毫摩尔数表示。
1.2.5.2 清除DPPH自由基（DPPH?）的测定 参考Liu等[21]方法进行，将4 mL的95%DPPH?乙醇溶液（10–4 mol?L–1）与提取物500 μL混匀后测定吸光度A517 nm，采用IC50评价橄榄苦苷及其水解产物抗氧化能力大小。 1.2.6 统计分析
实验数据以x±SD表示（n=3），用Duncan进行差异显著性检验（P<0.05），Origin 8.0软件进行作图。 2 结果与分析
2.1 LC-MS/MS测定橄榄苦苷及其水解产物
图2 LC-MS/MS测定油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷及其水解产物的总离子流色谱图
（注：1~6分别表示橄榄苦苷、橄榄苦苷元Oleuropein aglycon、烙醇苷元Ligstroside aglycon、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧
基甲基)烙醇苷元、羟基酪醇）
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LC-MS/MS测定油橄榄叶提取物水解液中橄榄苦苷及其水解产物（橄榄苦苷元Oleuropein aglycon、
烙醇苷元Ligstroside aglycon、去(羧基甲基)橄榄苦苷元、去(羧基甲基)烙醇苷元、羟基酪醇）的总离子流图如图2所示，其线性范围、回归方程和相关系数参数如表2所示。初始提取物（即未加水解酶）中各目标物含量如表2所示。由此可见，各成分在所述线性范围内线性关系良好（R2≥0.999），本方法简单、快速、灵敏，适用于橄榄苦苷及其水解产物的定性和定量分析。
表2 定量分析橄榄苦苷及其水解产物的的线性范围、回归方程和相关系数参数
成分 橄榄苦苷
橄榄苦苷元Oleuropein aglycon 烙醇苷元Ligstroside aglycon 去(羧基甲基)橄榄苦苷元 去(羧基甲基)烙醇苷元 羟基酪醇 线性范围（μg/mL）
0.01~20 0.001~5 0.001~5 0.001~5 0.001~5 0.001~5 回归方程 y=32401x+120.34 y=25601x+24.67 y=15491x+19.01 y=10065x+81.45 y=56310x+150.05 y=13850x+58.12 R2 0.9993 0.9998 0.9991 0.9998 0.9997 0.9991 提取物含量（μg/mL）
10.04 / / / / 0.18 2.2 酶种类的筛选
分别采用木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、β-葡萄糖苷酶（来自A. niger）、β-葡萄糖苷酶（来自杏仁）、半纤维素酶（A. niger）、纤维素酶等7种酶进行酶解实验，分析了不同酶对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷水解程度的影响，结果如图3所示。7种酶对油橄榄叶提取物中橄榄苦苷的水解效果顺序为：β-葡萄糖苷酶（A. niger）＞β-葡萄糖苷酶（来自杏仁）＞半纤维素酶（A. niger）＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞纤维素酶＞碱性蛋白酶。本研究发现，各种水解酶在醇提过程中可以不同程度提高橄榄苦苷的水解率，其原理在于各种水解酶作用于原料分子中，促进原料中的橄榄苦苷的释放；其中以β-葡萄糖苷酶的酶促水解效果最佳。木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶等蛋白酶均主要作用于蛋白质或肽，文件报道这些蛋白酶能使植物细胞壁和细胞膜结构被破坏，释放活性成分[15,19]，而本文研究发现这种效果较弱。
图3 非酶处理与不同种酶处理对橄榄苦苷水解率的影响
2.3 β-葡萄糖苷酶（A. niger）处理对橄榄苦苷水解产物的影响
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油橄榄叶提取物橄榄苦苷的酶法水解产物及其抗氧化能力的研究
