基因编辑技术的发展及其应用
李文，曹俊国，曹满园，李丹丽，许保增※
【摘 要】摘要：基因编辑技术是对基因组序列进行特定位点精确修饰的一种技术，是研究基因功能、基因组学、基因治疗等方面的有力工具。本文综述人工锌指核酸酶、类转录激活因子效应物核酸酶和规律性重复短回文序列簇3 种技术的结构原理、作用机理，并简述目前规律性重复短回文序列簇在动物基因组编辑中的应用，希望帮助人们对基因编辑技术的发展及现状有一个全面了解。 【期刊名称】特产研究 【年(卷),期】2019(041)001 【总页数】5
【关键词】人工锌指核酸酶；类转录激活因子效应物核酸酶；规律性重复短回文序列簇；动物基因组编辑
基金项目：国家自然科学基金面上项目（31772606）；吉林省国际科技合作项目（31772606）；吉林特研生物技术有限责任公司研发基金（20170015）；中国农业科学院创新工程（CAAS-ASTIP-2017-ISAPS）
基因编辑是一种对生物体基因组特定位点进行精确修饰的技术，通过对基因片段的敲除、敲入及替换，实现对生物体某一特性或性状的改变。最早的基因编辑技术出现在1986年，Thomas 等[1]通过基因打靶成功将抗药基因导入新霉素抗药缺陷细胞，使细胞重新恢复抗药性，其主要是利用了基因的同源重组原理。随后，基因编辑技术不断发展完善，先后出现了人工锌指核酸酶（Zinc finger nucleases，ZFN）技术、类转录激活因子效应物核酸酶（Transcription activator-like effector nucleases，TALENs）技术，与传统
基因编辑技术相比，新型技术具有更高的效率和打靶准确率，在生物基础研究、基因治疗、遗传改造等领域展现了巨大的潜力。2013年，Zhang 等[2]开发了利用规律性重复短回文序列簇（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/Cas endonuclease，CRISPR/Cas）系统对基因靶向编辑的新技术，大幅度提高了基因编辑的效率和可靠性，且相比前两种技术，其操作更加简便、成本较低。CRISPR/Cas 成为第3 代新型基因编辑技术，适用于包括生物技术、医药及临床在内的多种生物领域，掀起了国内、外基因编辑的热潮。
ZFN、TALEN 及CRISPR 技术都可以认为是一种用来纠正和编辑遗传缺陷的基因剪刀，三者在工具或方法上有差异，但原理基本是相同的。通过诱导双链DNA 断裂（DNA double strand breaks，DSBs），激活DNA 的自我修复机制，包括非同源末端连接修复（Non-homologous end-joining ，NHEJ）或同源重组修复（Homology-directed repair，HDR）两条途径。NHEJ是一种低保真度的修复过程，在DSBs 修复重连的过程中易发生碱基的随机插入或丢失，导致移码突变使基因失活, 实现目的基因敲除。若存在一个外源性供体基因序列，NHEJ 也会将其连入DSBs 位点，从而实现定点的基因敲入。而HDR 过程相对具有较高的保真度，在一个带有同源臂的重组供体存在的情况下，供体中的外源目的基因会通过同源重组过程完整的整合到靶位点，不会出现随机的碱基插入或丢失。如果在一个基因两侧同时产生DSB，在一个同源供体存在的情况下，可以进行原基因的替换。
1 ZFN技术
锌指核酸酶由特异识别DNA 的锌指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）和
FokⅠ核酸内切酶的剪切结构域两部分构成，是一种人工合成的融合蛋白。锌指结构（ZF）是ZFP的基本结构单位，存在于大多数蛋白质中的一种蛋白基序，1983年首次在非洲爪蟾的转录因子TFⅢA 中被发现[3]。ZF 在不同的物种间具有差异性，至今已发现了十几种不同结构，主要表现在锌指数目和相邻锌指间连接长度的不同。锌指核酸酶的N 端是多个Cys2-His2 锌指蛋白组成，每个蛋白可以识别DNA 双螺旋大沟的3bp 片段，同时早期有研究发现，带有3 个ZFP 的结构域能识别出9-18bp 的DNA 序列[3]。因此，可以构造不同的ZFP 结构域来特异识别DNA片段，目前，构造方法主要有直接构造法、模块组装法、文库筛选Wolfe 库、CoDA 法等。其中，应用较多的一种是模块组装法，即通过锌指模块（能识别连续3 个碱基的锌指作为1 个“模块”）预选库进行大量组合，能够识别多达64 种核苷酸三联体[4]。另一种寡聚体库工程法产生的ZFNs 对靶基因有更高的亲和性和特异性，但此方法目前未能设计出针对任意序列的核酸酶。将人工设计产生的ZFP 与非特异性FokⅠ剪切结构域结合形成具有活性的二聚体，即可对目标基因进行特异剪切。
ZFN 作为第一项被广泛使用的基因剪切工具，在小鼠、大鼠、玉米、斑马鱼及人类细胞中的技术建立已经较为成熟。2002年，Bibikova 等[5]利用ZFN 成功敲除果蝇X染色体上的Yellow基因，并且此变异能够稳定遗传到下一代，证明了ZFN可应用于动物的转基因研究。2010年，Watanabe 等[6]用ZFN 将猪原代成纤维细胞中稳定表达的增强型绿色荧光蛋白成功敲除，经检测分析，ZFN 诱导的突变包括在其切割位点的碱基插入或敲除、替换，为转基因猪的模型建立提供了一个方向。尽管ZFN 已在各领域广泛应用，但仍存在一些问题：1）ZFN 设计成本大、耗时长，并且目前不能设计针对任意靶基因序列相应的
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