铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌生物膜形成的影响
邓娟 孙伟 苏建荣
【摘 要】【摘要】目的 研究铜绿假单胞菌脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)对白念珠菌生物膜形成不同时期的影响。方法 甲基四氮盐 (XTT)减低法用于检测铜绿假单胞菌LPS对白念珠菌生物膜形成不同阶段生成量的影响，利用倒置显微镜观察生物膜形态学改变。结果 铜绿假单胞菌对白念珠菌生物膜形成的影响具有阶段差异性和浓度差异性。结论 铜绿假单胞菌LPS抑制白念珠菌生物膜菌丝的形成。
【期刊名称】中国真菌学杂志 【年(卷),期】2016(011)006 【总页数】4
【关键词】【关键词】铜绿假单胞菌；脂多糖；白念珠菌；生物膜 ·论著·
[Chin J Mycol，2016，11(6):337-340]
念珠菌与革兰阴性杆菌败血症是危重患者重要致死原因之一。近年来，由于各种体内植入物 (如心脏支架、口腔种植材料、导尿管等)、抗生素的滥用、HIV感染及应用免疫抑制剂等因素，白念珠菌血症感染率逐年升高[1]。白念珠菌能够黏附在导尿管、心脏支架、静脉插管、人工关节等人体植入物上形成生物膜[2]，从而对机体造成损害及对抗真菌药物产生明显耐药性[3]。因此，减少或阻断生物膜的形成可以有效提高抗真菌治疗效果，提高患者生存率。
铜绿假单胞菌是人体常见的机会致病菌，也是医院获得性血流感染的常见致病菌，而脂多糖 (lipopolysaccharide，LPS)是铜绿假单胞菌的主要致病成分之一，
是革兰阴性杆菌细胞壁的特有结构，又名内毒素，其可通过促炎反应和免疫调节机制引起发热、糖代谢紊乱、内毒素休克等[4]。脂多糖促炎性在脓毒症休克致病机制中起着重要作用[5]。尽管脂多糖对白念珠菌生物膜形成的体外实验数据较少，但许多体内研究表明脂多糖对白念珠菌感染的影响[6-7]。
本研究通过构建体外白念珠菌生物膜模型，采用甲基四氮盐 (XTT)法检测不同浓度铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌生物膜形成的影响，期望能为临床治疗混合性感染提供一定帮助，也期望能为研发新型抗真菌药物提供一定的实验室依据。
1 材料与方法
1.1 材料
菌株 白念珠菌标准菌株ATCC 90028 1株 (受赠于首都医科大学附属北京佑安医院临床检验中心微生物室)，白念珠菌标准菌株SC5314 1株，临床血培养阳性标本分离的32株白念珠菌，均来自首都医科大学附属北京友谊医院临床检验中心细菌室，使用前脱脂牛奶-70℃保存。
培养基 沙氏培养基 (SDA)购自Oxiod公司；RPMI-1640培养液购自Gibco公司；酵母氮源培养基 (Yeast nitrogen medium，YNB)购自Difco公司，称取YNB 3.35 g、葡萄糖10 g，加蒸馏水定容至500 mL，0.45 μm微孔滤器过滤除菌，4℃保存。
主要试剂 铜绿假单胞菌LPS、甲基四氮盐 (XTT)、甲萘醌均购自Sigma公司：LPS用RPMI-1640溶液调整成100 μg/mL～0.001 μg/mL浓度；XTT用无菌PBS缓冲液 (购自Solarbio公司)稀释配成0.5 mg/mL饱和溶液，0.22 μm微孔滤器过滤除菌，分装后-20℃冰箱冻存；甲萘醌用丙酮 (北京化学试剂厂，分
析纯)新鲜配制成浓度为10 mmol/L溶液。
仪器 恒温摇床，酶标仪，细胞计数板，倒置显微镜 (Olympus，日本)。 1.2 方法
念珠菌生物膜的制备 将从-70℃冰箱保藏的待测菌株接种于SDA培养基上，37℃、5%CO2培养18 h。取一接种环菌量至YNB培养液中，37℃摇床 (75 r/min)培养过夜，离心，弃上清，PBS液离心洗涤2次 (4 000 r/min，5 min)。用含或不含有不同浓度LPS (100 μg/mL～0.001 μg/mL)RPMI-1640液体培养基稀释菌液，显微镜下用细胞计数板将菌液浓度调整至5×106 cells/mL。取100 μL上述菌液接种至无菌96孔板中，37℃摇床 (75 r/min)培养90 min，然后用PBS轻轻洗涤2次，以洗掉未黏附的念珠菌细胞，再加入含或不含不同浓度LPS (100 μg/mL～0.001 μg/mL)RPMI-1640液体培养基200 μL，继续培养24 h和48 h，每隔24 h换液1次。阴性对照孔为不含LPS的RPMI-1640培养基。实验在不同时间重复3遍。
XTT减低法进行生物膜定量分析 在90 min、24 h、48 h时刻点，弃去96孔板中培养液，每孔用200 μL PBS缓冲液洗2遍，然后每孔加入40 μL XTT、2 μL甲萘醌、158 μL PBS缓冲液，37℃避光孵育3 h后，用酶标仪测定念珠菌生物膜在490 nm处的吸光度值 (A值)。
倒置相差显微镜观察生物膜形态 按上述方法进行念珠菌生物被膜的制备，24 h后于倒置显微镜下观察念珠菌生物膜形态并拍摄照片。 1.3 统计学分析
用SPSS 17.0进行统计学分析。数据用均值±SD表示，白念珠菌生物膜量实验组与对照组的比较用Student's t检验，P<0.05认为有统计学意义。
铜绿假单胞菌脂多糖对白念珠菌生物膜形成的影响
