Q-PCR实验流程
1. 确定进行Q-PCR的引物能够将目的基因扩增出唯一的目的条带，并且分子量应该保持在
200bp左右；
2. 将之前反转录得到的cDNA样本按照需要进行稀释，然后每孔按照如下体系进行加样：
cDNA 2ul F-primer 0.75ul R-primer 0.75ul SYBR 12.5ul ddH2O 9ul ———————————
Total 25ul
反应需要设置内参组，处理组和非处理组共三组，其中各组详细内容解释如下：
内参组（actin） 处理组（B） 非处理组（A）
每个反应组需要进行3个重复（生物学重复），已确保数据的可靠性并且需要明确加样顺序，Q-PCR使用8联排进行反应，加样后需要盖上透明盖子；
3. 选用 Bio-Rad CFX Q-PCR仪进行实时定量PCR，选用程序可参考文献报道的程序；
4. 反应结束后考取实验结果，并将反应后样品保留，需要进行凝胶电泳确保反应结果为单
一条带并注意实验结果的Tm 值和Cycle数，以明确实验结果的真实性； 5. 实验数据由相关软件打开后导出为Excel2003格式进行处理，数据处理方案选取 方
案，其相关处理方法如下：
（ ） 1） 计算内参组的平均值，即生物学重复的均值，
Every cDNA X Actin primer 处理（给以不同刺激） B cDNA X Every primer 非处理（给以不同刺激） A cDNA X Every primer ； ,
2） 用处理组和非处理组的Cq值分别减去对应的内参组均值，即
;
3） 计算减去内参值后的非处理组的均值，即 （ ） 4） 计算处理组与非处理组之差，即 ，同时需要计
算非处理组与非处理组之差，即 ；
5） 计算2的- 次幂，即 （ ）；
6） 运用Graph Pad进行数据图像绘制，即可得到直观的图像数据。 注意：
A． 尽量保证SYBR避光；
B． 尽量保证使用的Q-PCR 8联排的透明盖子的表面没有磨损，如有磨损可能会影响到仪器
的读数；
C． Cq的读数范围应当避免超过30，如超过30，我们可以判定该cDNA中无此基因的表达； D． Q-PCR之前务必需要进行常规PCR，确保设计的引物只能扩增出唯一正确的主带。 E．
QPCR实验操作
