第十五章植物离体快速繁殖和脱毒技术

第十五章 植物离体快速繁殖和脱毒技术

第一节 植物离体快速繁殖的概念与应用

一、植物离体快速繁殖技术的概念

植物离体快速繁殖技术是植物生物技术的一个重要组成部分，通过离体培养，将来自优良植株的茎尖、腋芽、鳞片、叶片等器官、组织或细胞进行离体培养，以期在短期内以更快的速度获得遗传上稳定一致的大量个体。这种无性繁殖方式与传统无性繁殖方式的区别在于繁殖速度快，不受自然的干扰，使育苗工 厂化。

二、植物离体快速繁殖技术的目的与应用前景

植物离体快速繁殖技术已广泛应用于花卉、蔬菜、林木和药材生产，目的在于扩大繁殖珍稀植物原始材料和品种资源，繁殖经济效益高但难以繁殖的植物，繁殖和保存无病毒原种材料及销售量大而传统无性繁殖难以满足需求的植物。

植物离体快速繁殖技术已在全球范围内发展起来，试管苗产业已经形成并在迅速发展，前景广阔。尤其是在发展中国家，由于投资少、见效快，植物离体快速繁殖技术常作为植物生物技术的主要内容。快速繁殖也是生物技术应用于农业生产的中间环节之一。目前很多通过基因工程、体细胞无性系变异、原生质体培养等手段获得的新品系或品种，尤其是通过营养繁殖的植物，往往需要通过离体快速繁殖技术才能使其迅速进行田间试验和生产，及早推向市场。现在试管植物的生产已由早期的以观赏植物为主逐渐发展到果树、林木、蔬菜及某些大田作物。

第二节 植物离体快速繁殖技术程序与关键

一、植物离体快速繁殖技术的程序

植物离体快速繁殖程序如图15.1所示。

无菌母株制备不定芽增殖殖完整植株形成再生植株锻炼与移植再生植株鉴定

图15.1 植物离体快速繁殖技术程序示意图

二、植物离体快速繁殖技术的关键 1. 防止污染，保证快速繁殖的质量和速度

有无污染是影响试管苗质量好坏和整个生产成败的关键因素之一。植物材料应清洗干净和进行表面消毒，接种后及时检查并弃去污染的培养物，未污染材料进行继代培养和扩大繁殖。有时已污染的材料由于比较宝贵或认为对培养物的生长影响不大，仍继续使用和扩大繁殖，但应对污染问题予以足够的重视。

污染来源主要有二：一是植物表面消毒不彻底，或是由植物材料内部的微生物随着材料进入培养过程，这些微生物一般不能通过表面消毒清除；二是在操作和培养过程中微生物进入培养器皿。

首先应重视植物材料的选择与灭菌，除选择干净、健康无病虫害的材料外，尽可能使用温室和培养室或人工气候箱中培养的植物材料。如果有些材料只有在田间或天然条件下才能获得，尽可能用新生长的部分作为培养材料。较清洁的材料，可采用一般消毒灭菌方法；容易污染的材料取材前用杀菌剂或抗生素处理后，再用一般方法进行消毒灭菌。其次，对培养物作进一步检查以保证培养物质量；扩大繁殖时应有合理的程序，避免交叉感染。

2. 植物材料预处理

预处理的目的主要是获得比较清洁的材料和改变母株与外植体的生理状态，使其接种后能更好地生长和分化。对某些光周期敏感的植物，在控制光周期条件下培养母株，可以得到对培养条件反应更稳定的外植体。而对于需要低温打破休眠的植物，低温处理对培养物以后的生长和分化有利，如某些鳞茎和木本植物。

3. 芽的增殖

芽的增殖是植物离体快速繁殖过程中最主要的阶段，通过芽的增殖可以达到个体迅速增殖的目的。芽的增殖途径分为侧芽（腋芽）途径、器官发生途径和体细胞胚胎发生途径。侧芽途径包括丛生芽和单节腋芽两种。器官发生途径通过不定芽的形成在外植体或愈伤组织上产生带芽的休眠器官（如小鳞茎、小球茎、小块茎等），其中不定芽可直接来源于外植体或从继代培养的愈伤组织上产生或从不定根上形成。

芽的增殖要做到不污染，移栽成活率较高或在进行微扦插时成活率较高，成活后能正常生长发育，遗传变异低，试管苗均匀度高，以保证快速繁殖的质量和效率。

4. 变异的来源和控制

变异是植物快速繁殖中普遍存在的问题，控制变异是保证试管苗质量的关键技术之一。但变异是快速繁殖过程中极为复杂的问题，可能来源于外植体自身，如母体植株是嵌合体，当外植体取材和培养条件不合适时，嵌合体被破坏，原植株的性状就不能保持；也可能是由于植物材料中非嵌合体的染色体变异，或由于某些植物病毒（源体）分布不均匀所造成。因此，只有明确变异的来源，才能有效控制变异发生。

5. 根的诱导

除有些植物可以在芽分化和生长的同时在嫩枝或芽丛基部产生根外，多数都要经过一个独立的生根（或根诱导）阶段。根的诱导可以在离体条件下进行，也可以在试管外进行。将无根的嫩枝或苗作微扦插，可以节省大量人力、物力和时间。

微扦插时要注意苗或嫩枝应生长健壮，茎要有一定长度。对于难生根的植物，在扦插前可用生长素粉剂处理。常用的生长素有吲哚丁酸（IBA）、萘乙酸（NAA）和萘氧乙酸（NOA）。很少使用2，4-D类生长素，因该类生长素活性强、毒性大。另外应注意选择好保水和疏松的基质，如珍珠岩、草炭等，并应对其进行消毒灭菌及pH值的调节。

另一个有发展前途的方法是在离体条件下诱导微型休眠器官的形成，如目前国内外广泛开展的马铃薯微型薯生产。

无根丛生芽的生根诱导或嫩枝，诱导生根时需将丛生芽用解剖刀仔细分割，再选择合格材料接种。这种方法已成功应用于很多种观叶植物。

离体培养条件下诱导生根时，需在培养基中加入一定量的生长素，或在不含任何生长素但加有活性炭（0.5%～1.0%）的培养基上诱导生根。对一些难生根的培养材料，可以用生长素与黑暗处理相结合的方法而获得较好的效果，有的还需要较长时间的黑暗处理。为促进根系更好地生长，经适宜浓度生长素诱导生根后，有时要将材料转移到无激素培养基上进行培养。

6. 再生植株的锻炼与移栽

培养容器内的小植株生长势很弱，对外界环境的适应能力较差，移栽于土壤前应进行日光和湿度锻炼。 湿度锻炼是在小苗移栽前一周打开培养容器口进行锻炼。移栽时应将小苗基部的培养基冲洗干净。 7. 再生植株的鉴定

① 细胞学鉴定：为鉴定植物离体快速繁殖后代植株在遗传上是否与其亲本一致，需对再生植株群体进行抽样，检测其根尖染色体数目以及减数分裂期染色体行为。

② 形态学鉴定：在田间鉴定再生植株植物学性状，发现与其亲本不同的变异株时应再进行细胞学鉴定。

第三节 植物脱毒的原理与植物脱毒的程序

一、具有分生能力的茎尖是用于植物脱毒的最为理想的材料

是因为：

(1)、分生组织细胞很活跃，可抑制病毒核酸的复制。

(2)、分生组织中由于维管组织还不健全，可抑制病毒向分生组织的传导。 (3)、分生组织中由于具有较高水平的生长素和细胞分裂素，可阻滞病毒的侵入或者抑制病毒的合成。 (4)、Stace-Smith提出（1969），在分生组织中由于缺乏或还没建立可能用于病毒合成的酶系统， 所以，病毒无法在分生组织中复制。

(5)、Martin-Tanguy等提出（1976）抑制因子假说，认为在分生组织中存在某种抑制因子。

二、植物脱毒的技术规程 1、母体植株的选择和预处理

选择具有典型特征的植株作为外植体的供体，且外植体健康。 2、茎尖分生组织培养再生植株 3、脱毒效果的检测 4、脱毒苗的保存与繁殖

三、影响脱毒效果的因素

1、母体材料病毒侵染的程度 2、起始培养的茎尖大小 3、外植体的生理状态