第29卷第3期2020年6月
CHINESE JOURNAL OF HISTOCHEMISTRY AND CYTOCHEMISTRY
中国组织化学与细胞化学杂志
Vol.29.No.3June.2020
基因编辑动物模型制备虚拟仿真实验教学平台
的设计开发
张霞，苗义良
1
2,3*
(1华中农业大学动物医学国家级实验教学示范中心，2华中农业大学动科动医学院干细胞与再生生物学研
究所，3华中农业大学农业动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室，武汉 430070)
〔摘要〕基因缺失或突变动物模型的制备对于研究基因功能和构建人类疾病模型具有重要的作用。目前在大动物上构建疾病模型主要通过体细胞基因编辑和动物克隆技术相结合来实现，但这两项技术涉及环节众多，技术要求高，特别是显微操作技术。为了能让更多的本科生、研究生生和技术人员学习和掌握该技术，特以猪为对象利用虚拟仿真技术开发出基因编辑克隆动物制备的虚拟仿真实验系统。该系统不但节约了操作的成本和时间，学习者可以身临其境地进行高难度的实验操作，本文将具体介绍该系统的设计和开发。
〔关键词〕虚拟仿真实验；基因编辑；动物克隆；实验教学
〔中图分类号〕S814.8 〔文献标识码〕A DOI：10.16705/ j. cnki. 1004-1850. 2020. 03. 017
Design and Development of virtual simulation experimental teaching platform for
preparation of genome editing animal model
Zhang Xia1, Miao Yiliang 2,3*
(1National Demonstration Center for Experimental Veterinary Medicine Education, 2Institute of Stem Cell and Regenerative Biology, College of Animal Science and Veterinary Medicine, 3Key Laboratory of Agricultural Animal Genetics, Breeding and Reproduction of
Ministry of Education, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)
〔Abstract〕The derivation of animal models with gene knockout or mutant plays an important role in studying gene function and constructing human disease models. The current disease models in large animals are mainly established through the combination of somatic cell gene editing and animal cloning technology. However, these two technologies are involved in many manipulation steps and each step requires high technology, especially micromanipulation technology. In order to allow more undergraduates, postgraduates and technicians to learn and master this technology, a virtual simulation experiment system for genome editing cloning animals has been developed by taking pigs as as the object and using virtual simulation technology. This system not only saves the cost and time of operation, but also provides a platform by which the learner can immersively carry out the complicated experimental operation. This paper will introduce the design and development of this system.
〔Keywords〕Virtual simulation experimental system; gene editing; animal cloning; experimental teaching
基因缺失或突变动物模型的制备对于研究基因功能和构建人类疾病模型具有重要的作用。近年来随着基因编辑技术的不断完善和发展，该技术可实现对动物基因组上特定DNA片段的删除、插入或修饰。该类动物模型为人类疾病的发病机制、筛选治
疗药物、预防疾病发生提供了研究的素材。目前所采用的动物主要包括以大小鼠为代表的啮齿类和以猪猴为代表的大动物。猪的器官在解剖、形态及生理功能上与人类的器官最相似，所以猪常被使用来构建异种器官移植和人类疾病模型[1]。近几年来，随着以CRISPR/Cas9 技术为核心的基因编辑技术的迅猛发展，该技术不仅可快速高效地在猪基因组上
〔收稿日期〕2020-01-06 〔修回日期〕2020-06-10
〔基金项目〕2019 年度华中农业大学教学改革研究项目
(2019137)
敲入或敲除基因，还可同时编辑多个相关的基因，从而实现在人类疾病模型的构建[2,3]。由于猪的胚胎干细胞还未真正建立起来，所以目前在猪上构建疾病模型只能通过体细胞基因编辑和动物克隆技术相结合来实现，该技术已成为大动物模型构建领域的
〔作者简介〕张霞，女（1982年），汉族，实验师
*通讯作者(To whom correspondence should be addressed)：miaoyl@mail.hzau.edu.cn
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热门技术。但是该项技术涉及环节众多，技术要求高[4]，特别是显微操作技术需要一年甚至更长时间的练习才能掌握，所以目前国内只有少数几个实验室可以进行基因编辑克隆猪的生产。
虚拟仿真实验是指借助于多媒体技术和虚拟现实等技术，在计算机和网络上搭建的可辅助甚至替代传统实体实验操作环节的相关软硬件操作环境[5]。虚拟仿真实验颠覆了传统的实验方式，使得实验操作超越了时空和实验条件的限制[6]，学生随时随地都可以在互联网终端进行操作，有利于实验教学资源的共享[7]。多样的教学形式更是给学生带去了全新的学习体验，丰富了传统的教学内容，对于教育事业发展中具有积极的促进作用[8]。
将基因编辑克隆猪技术与虚拟仿真相结合，学生在虚拟环境下完成模拟实验操作，可以解决这种高难度实验项目难以在本科生中开展的问题。2018年我们建成了“猪基因编辑克隆技术虚拟仿真实验项目”，并在华中农业大学虚拟仿真实验教学中心上线运行（http://shenbao.ilab-x.com/details?id=2948），项目的实施大大提高了实验教学质量和学生的实践能力，最大程度地发挥了该虚拟仿真实验项目的育人效益和社会效益。
1 基因编辑克隆猪制备虚拟仿真实验建设的意义
基因编辑克隆猪制备是猪繁育领域的热门技术，但是由于环节众多，操作复杂，实验教学比较困难。例如实验教学中体细胞核移植需要倒置显微镜和显微操作系统，显微操作系统操作复杂、价值昂贵、数量较少，不能让学生亲自操作，不利于培养学生的动手能力和创新思维。将虚拟仿真技术与基因编辑克隆猪相结合，可以生动、逼真的模拟实验操作的整个过程，加深学生对知识的理解，弥补了目前现实实验条件的不足，为学生今后的学习、工作打下坚实的基础。
基因编辑克隆猪技术包含的内容丰富，包括载体构建、原代细胞的培养、细胞的冻存和复苏、体细胞的基因编辑、卵母细胞的成熟、胚胎培养、显微操作、细胞融合等技术。完成此试验，可让学生在分子生物学实验技术、胚胎工程技术等相关技术上得到全面而综合的锻练，使学生的综合技能得到全面提高。
由于体细胞克隆技术操作复杂、技术水平要求
较高，并且显微操作技术从开始学习到熟练掌握甚至需要半年到一年的时间，所以在本科生中很难开展，而将本试验做成虚拟仿真实验，学生在虚拟环境下完成模拟实验操作，可以解决这种高难度实验项目难以在本科生中开展的问题。
2 基因编辑克隆猪制备虚拟仿真实验建设路线
基因编辑克隆猪制备的虚拟仿真实验分为教学模式、练习模式和考核模式。教学模式是练习模式的录屏，通过该模式的学习，学生可以初步掌握整个实验的流程。练习模式是在提示下通过鼠标和键盘对虚拟的实验室画面进行控制，完成每个环节的实验操作，通过该环节的反复练习，学生能够熟练掌握每一个实验步骤。考核模式是把所有的提示部分去掉，学生按照练习模式的操作完成实验，每一个模块完成后，系统会根据操作的熟练程度给出相应的分值，以达到考核目的。教师可通过后台管理，看到每位学生的操作过程和考核成绩，了解学生实验操作中的难点和易错点[9]。
3 主要功能模块
根据实验流程，把整个项目分成了8个模块，涵盖了所有的实验环节，每个模块是一个独立的环节，但是又相互关联（图1）。3.1 MSTN敲除基因构建模块
以MSTN基因的敲除为例，介绍了如何设计sgRNA以及整个敲除载体的构建流程。该模块包含了酶切、连接、转化等分子生物学实验的原理及操作过程，学生通过该模块的操作能熟悉分子实验的操作规范，培养严谨的学习态度。模块中把每个小的环节独立出来，可以实现个性化练习，不必每次都从头开始。另外我们把一些抽象的载体构建原理用动画展示出来，帮助学生深入理解分子生物学实验的奥妙。
3.2 胎儿成纤维细胞原代培养及冻存模块
该模块包含猪胎儿成纤维细胞的分离培养和细胞冻存的过程，学习完这个模块学生对细胞培养就有了一个深刻的认识，可以作为细胞培养初学者的培训材料。
3.3 体细胞的基因编辑模块
该模块是将模块一构建的载体转入模块二培养的胎儿成纤维细胞中，主要涉及了细胞的核转，如何挑选挑选阳性细胞等。通过对该模块的学习，学
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生能够掌握细胞转染的方法以及如何进行细胞克隆挑选。
3.4 固定针和注射针制备模块
模块四介绍制作显微操作时使用的固定管和注射管的过程。由于显微操作针末端非常精细，注射针末端只有20微米，所以这一部分内容基本都是在显
微镜下操作。目前各个实验室中使用的断针仪和磨针仪上并没有摄像头的设计，即使在科研实验室学习这部分操作的时候也很难看到实时操作的镜头，该模块把所有镜下镜头全部进行了实时模拟。通过该模块的学习学生可以非常容易的掌握制作显微操作针的关键所在（图2）。
图1 基因编辑克隆猪制备虚拟仿真实验的模块入口
Fig.1 Module entrance of preparation for gene-editing cloning pig virtual simulation experiment
图2 显微操作针的制备过程
Fig. 2 Preparation process of micro-operation needle
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3.5 卵母细胞成熟培养模块
分类以及成熟培养的过程。模块中设置了问题互动环节，必须答对题目才可以进行下一步实验，比如COCs的分类选择，要求学生按分类标准选择出适合
进行培养的COCs。另外模块中还穿插了一些知识点的体视镜等等。通过该模块的学习学生可以熟练掌握猪卵母细胞成熟培养的过程（图3）。
该模块包含抽卵、卵丘卵母细胞复合体（COCs）的提示，比如培养猪卵母细胞为什么需要带加热台
图3 卵丘卵母细胞的挑选
Fig. 3 Collection of cumulus oophorus complex
3.6 体细胞核移植模块
该模块是这整个项目中操作难度系数最高的部分，该部分包括成熟卵母细胞挑选，体细胞核移植，重构胚的电融合以及胚胎培养等环节。该环节基
本都是显微镜下的镜头，我们把镜下的镜头进行了实时模拟并且能够实现人机互动，利用鼠标和键盘实时操作显微镜下的画面。学生通过这个模块的学习，可以亲身感受显微操作过程中的乐趣（图4）。
图4 显微操作的去核过程
Fig. 4 Oocyte enucleation process for micromanipulation
3.7 胚胎移植模块
该模块包括受体猪的挑选、麻醉、术前准备、胚胎移植手术以及术后护理。该模块不仅涵盖了繁
殖学的知识还包括了很多外科手术的操作技术，通过该模块的学习和练习学生可以熟练掌握胚胎移植的手术操作（图5）。
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图5 胚胎移植手术过程
Fig. 5 Embryonic transplant process
3.8 基因编辑克隆猪的基因型鉴定模块
该模块介绍基因编辑克隆猪出生后如何鉴定基因型，主要包括组织DNA的提取和PCR等环节。4 基因编辑克隆猪制备虚拟仿真实验系统的应用
将虚拟仿真技术应用到组织学与胚胎学、生殖生物学以及动物分子生物学实验教学中是将优势学科专业与信息技术的深度融合，是对传统的实践教学理念、教学方法进行改革
[10]
参 考 文 献
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，通过虚拟仿真实验
和学生实际操作，开展虚实结合、线上线下混合式的学习方法。实验课前，安排学生进行线上模拟，学生可根据老师的讲授和虚拟实验平台中的提示，自主完成实验每一个实验步骤均获得评分，通过在线学习学生既复习巩固了课堂知识也系统了解各个关键技术环节的操作和原理。选取部分实验让学生进行实际操作，实验过程中观察问题、寻找答案并提出新的问题，经过分组讨论、总结后提交实验报告。实验结束后，带着问题继续线上探索，再次进行虚拟实验，使学生产生新的思考和认识，对所涉及的知识原理和问题本质进一步消化理解、融会贯通，完善专业知识体系。这种教学方法的改革可以显著提高动物科学专业本科生教学质量，使学生更好的适应相关工作，并且有助于开拓学生的国际视野，掌握当前领域内最新的技术前沿，坚定学生的学业和职业目标。
[4]
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