昆明景润 食品有限公司 作业指导书 文件号: KJWI-QA-27 版本:A/1 日期:2012-05-25 页数: Page 1 of 12 标题： 大肠菌群计数方法 文件修改记录 版本 0 A 编写: 杨剑莉 审核: 李昌朋 批准：伏丽玲 修订修订日期 次数 0 2011-02-14 1 2012-05-25 修订 修 订 内 容 昆明景润 食品有限公司 分发号 : ______(仅适用于控制文件) (仅盖有红色印章的文件才有效) 作业指导书 文件号: KJWI-QA-27 版本:A/1 日期:2012-05-25 页数: Page 1 of 12 标题： 大肠菌群计数方法 1.0 目的 规定大肠杆菌计数的方法。 2.0 适用范围 适用于加多宝凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中的大肠杆菌群的计数。 3.0 术语 3.1 大肠菌群：一群在36℃条件下培养48h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧格兰仕隐形无芽孢杆菌。 3.2 MPN最可能数（most probable number）：基于泊松分布的一种间接计数方法。 4.0 职责 4.1 质检部：负责按此方法对加多宝来凉茶、浓缩汁、工艺水等产品或原辅材料中大肠菌群进行计数。 5.0 流程图 见附录A、附录B。 6.0 内容及要求 6.1 设备和材料 除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其它设备和材料如下： 6.1.1 恒温培养箱：36℃±1℃ 6.1.2 冰箱：2℃-5℃ 6.1.3 恒温水浴箱：46℃±1℃ 6.1.4 天平：感量0.1g 6.1.5 振荡器 6.1.6 无菌吸管：1ml（具0.01刻度）、10ml（具0.1刻度）或微量移液器及吸头。 6.1.7 无菌锥形瓶：容量500ml 6.1.8 无菌试管：18×200ml 编写: 杨剑莉 审核: 李昌朋 批准：伏丽玲 昆明景润 食品有限公司 作业指导书 文件号: KJWI-QA-27 版本:A/1 日期:2012-05-25 页数: Page 1 of 12 标题： 大肠菌群计数方法 6.1.9 小导管 6.1.10 无菌培养皿：直径90mm 6.1.11 菌落计数器 6.2 培养基和试剂 6.2.1 月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤 煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤 乳糖胆盐发酵培养基（LBB） 乳糖蛋白胨培养基（LPB） 伊红美蓝琼脂培养基（EMB） 结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA） 75%乙醇溶液 无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000ml蒸馏水中，121℃高压灭菌15min 6.3 大肠菌群MPN计数法 6.3.1 加多宝凉茶、浓缩汁等产品及原辅材料中大肠菌群的测定 6.3.1.1 样品稀释 a、固体和半固体样品：称取25g样品置于盛有225ml无菌生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1-2min，制成1：10的样品匀液。 b、液体样品：以无菌吸管吸取25ml样品置于盛有225ml的无菌生理盐水的无菌锥形瓶中，充分混匀，制成1：10的样品匀液。 c、用1ml无菌吸管吸取1：10样品匀液1ml，沿管壁缓慢注入盛有9ml无菌生理盐水的试管中（注意吸管或吸头尖端不要触及稀释液面），振摇试管，制成1：100的样品匀液。 d、根据对样品污染状况的分析，按上述操作，依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。注意每递增稀释依次，换用一次1ml灭菌吸管。从制备样品匀液至样品接种完毕，全过程不得超过15min 6.3.1.2 初发酵试验 a、每个样品，选择3个适宜的连续稀释度的样品匀液（液体样品可以选择原液），每个稀释度接种3管月桂基硫酸胰蛋白胨（LST）肉汤，每管接种1ml（如果接种量超过1ml，则用双料LST肉汤）。 编写: 杨剑莉 审核: 李昌朋 批准：伏丽玲 6.2.2 6.2.3 6.2.4 6.2.5 6.2.6 6.2.7 6.2.8 昆明景润 食品有限公司 作业指导书 文件号: KJWI-QA-27 版本:A/1 日期:2012-05-25 页数: Page 1 of 12 标题： 大肠菌群计数方法 b、将以上接种好的试管置于36±1℃培养24±2h，观察导管内是否有气泡产生，如未产气则继续培养至48±2h。记录在24h和48h内产气的LST肉汤管数。未产气者为大肠菌群阴性，产气者则进行复发酵试验。 6.3.1.3 复发酵试验 用接种环从所有48±2h内发酵产气的LST肉汤中分别取培养物1环，移种于煌绿乳糖胆盐（BGLB）肉汤管中，36±1℃培养48±2h，观察产气情况。产气者，计为大肠菌群阳性管。 6.3.1.4 大肠菌群最可能数（MPN）的报告 根据大肠菌群阳性管数，检索MPN表（见附录C），报告每克（或每毫升）样品大肠菌群的MPN值。 6.3.2 工艺水等水样中大肠菌群的测定 6.3.2.1 推测性试验 a、取待检样品10ml，接种到10ml双料的乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培养液中，共接种5管；对于可能存在污染的水源，取待检样品10ml、1ml、0.1ml（取样品1ml于9ml无菌生理盐水中稀释，取稀释后的样液1ml），分别接种于含10ml双料、单料和单料乳糖胆盐发酵培养液或乳糖蛋白胨培养液中，各接种5管。 b、如果水样污染较严重，应加大稀释度，可接种1ml、0.1ml、0.01ml甚至0.1ml、0.01ml、0.001ml，每个稀释度接种5管，每个水样共接种15管。接种1ml一下水样时，必须做10倍递增稀释后，取1ml接种，每递增稀释一次，换用1支1ml灭菌刻度吸管。 c、将以上接种好的试管置于36±1℃培养箱内培养24±2h，如所有乳糖胆盐发酵管或乳糖蛋白胨发酵管都不产气，则可报告为大肠菌群阴性，如有产气者，则按下列程序进行。 6.3.2.2 确证性试验 6.3.2.2.1方法一 a、分离培养 将产酸产气的发酵管分别转种在伊红美蓝琼脂平板上，置于36±1℃升华培养箱内，培养18-24h取出。观察菌落形态，用接种换挑取符合下列特征的菌落作革兰氏染色、镜检和证实试验。 编写: 杨剑莉 审核: 李昌朋 批准：伏丽玲 昆明景润 食品有限公司 作业指导书 文件号: KJWI-QA-27 版本:A/1 日期:2012-05-25 页数: Page 1 of 12 标题： 大肠菌群计数方法 ① 菌落呈深紫黑色，表面有金属光泽； ② 紫黑色、不带或略带金属光泽的菌落； ③ 淡紫红色、中心较深的菌落。 b、证实试验 经上述染色镜检为革兰氏阴性无芽孢杆菌，同时接种乳糖胆盐发酵管内，置于36±1℃升华培养箱培养24±2h，有产酸产气者，即证实有大肠菌群存在。 6.3.2.2.2方法二 自推测性检验阳性管中取1接种环培养液，接种到煌绿乳糖胆盐（BGLG）肉汤中，置于36±1℃培养箱内培养48h。观察BGLG管中的产气情况，如有气味产生，就可确定为大肠菌群阳性，如无则为大擦汗那个菌群阴性。 6.3.2.3 结果报告 根据证实为大肠菌群阳性的管数，查MPN检索表，可得出水样中大肠菌群的MPN 值。5管法见附录E。稀释样品查表后所得结果应乘以稀释倍数。如所有乳糖胆盐发酵管均为阴性时，可报告大肠菌群未检出。 6.4 大肠菌群平板计数法 6.4.1 样品稀释按6.3.1.1执行 6.4.2 平板计数 6.4.2.1 选取1-3个适宜的稀释度（液体样品可以选用原液）接种两个无菌平皿，每皿1ml，同时分别取1ml无菌生理盐水加入到两个无菌平皿作空白对照。 6.4.2.2 及时将冷却至46℃的结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）15-20ml倾注于每个平皿中。小心旋转平皿，将培养基与样液充分混匀，待琼脂凝固后再加3-4ml结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）覆盖平板表层。翻转平板，置于36±1℃培养箱内培养18-24h。 6.4.2.3 选取菌落数在30-150之间的平板，分别计数平板上出现的典型和可疑的大肠菌群菌落。典型菌落为紫红色，菌落周围有红色的胆盐沉淀环，菌落至今岗位0.55mm或更大。 6.4.3 证实试验 编写: 杨剑莉 审核: 李昌朋 批准：伏丽玲
KJWI-QA-27 大肠菌群计数方法作业指导书
