目的：
确定植物文库在酵母菌株INVSc1中耐盐（NaCl）程度。 方法：
将pYES空载转化酵母菌株INVSc1作为对照组，通过酵母表型验证，判断植物文库抗盐（NaCl）程度。 材料： 1．载体：pYES 2．培养基：
1). 酵母完全培养基：
YPDA：1% Yeast extract，2% Tryptone，2% Glucose, 0.02% Adenine。 2). 酵母缺陷型筛选培养基：
参照Clontech公司的PT3024-1/Yeast Protocols Handbook，其中各种培养基分别以下列符号表示：SD-U：-Ura，SG-U：-Ura。 3. 其他贮备液：
10 × TE：0.1 M Tris-HCl（pH7.5），10 mM EDTA，高压灭菌； 10 × LiAc：1 M LiAc (pH7.5)，高压灭菌。 4.氯化钠NaCl：
配制好SG-U固体培养基后加入，培养基中的NaCl终浓度为0、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6 M。 第一部分 载体构建
载体构建部分送公司合成。 第二部分 将质粒转化受体菌INVSc1 1.1酵母转化
将以下质粒分别转入INVSc1中：
Reaction
1
1.2 酵母转化方法
1. 从YPDA平板挑取INVSc1单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5。
2. 转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5h，至OD600=0.6。 3. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4. 用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
5. 用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
6. 用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul（每个转化），备用。
7. 每个1.5 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
240 ul
1 LiAc 36 ul
M ssDNA
mg/ml)
5 ul
(20
质粒DNA 5 ul
plasmid pYES
涂板种类 SD-U
备注 对照组
8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏，30 min。
11. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
12. 每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型
筛选平板。
13. 30℃恒温培养4天。 1.3 阳性克隆 PCR验证
从转化的平板上随机挑取8个点，进行PCR验证。 第三部分 将植物文库转化受体菌INVSc1 1.1 文库质粒转化
1. 从YPD平板挑取单菌种接于液体YPD培养基5 ml，30℃，225 rpm，振荡培养24 h。
2. 转接于YPDA液体50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。
3. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4. 用30 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
5. 用20 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
6. 用10 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清。
7. 向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
9.6 ml
1 M LiAc 1.44 ml
ssDNA (10 mg/ml)
300 ul
文库质粒DNA
25 ug
8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏1 h。
11. 离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清，用6ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 ul培养物稀释后涂SD-U平板，共20块。 12. 30℃恒温培养3-7天，观察菌落生长。
13. 待菌落长出，用YPD液体培养基把板上菌落刮下，以500 ul/管分装，加入500 ul 50%甘油制备成酵母工作菌液，保存于-80℃。
14. 从中取10 ul稀释105倍，涂布于SD-U平板，用于检测文库库容，30℃恒温培养3-7天，观察菌落生长并计数。
15. 随机取24个克隆进行菌落PCR验证文库转化质量。 第四部分 盐浓度筛选
1. 制备一系列分别含有0 M、0.5 M、1.0 M、1.3 M、1.5 M、2.0 M NaCl的SG-U（半乳糖取代葡萄糖）固体培养基。
2. 取工作菌液与空载对照菌株，用ddH2O稀释至OD600=0.6。
3. 分别吸取100 ul涂布于上述一系列平板中，30℃恒温培养7天后，观察菌落生长情况，确定盐筛选浓度。
4. 在上述浓度下，涂布文库工作菌液，共20个平板。 第五部分 实验结果 5.1 文库库容
5.2 文库质量检测
5.3 盐浓度筛选 文库菌液：
对照菌液：
结论：选择1.5 M NaCl浓度作为文库筛选条件。
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酵母高通量筛选耐盐基因结题报告 - 图文
