引物合成常见问题
Q1.引物是如何合成的?
目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。
DNA合成仪有很多种，无论采用什么机器合成，合成的原理都
相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。
去保护：加入 Deblocking脱去碱基上5'- OH的保护基团DMT，获得游离的5'- OH ； 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基
5'-OH仍然被DMT保护，3'端被活化与溶液中游离的
5'-OH发生耦合反应；
封闭：耦合反应中极少数 5'- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应； 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。
Q2.引物合成如何处理?
切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解 核苷之间的酯键。断裂下来CPG与初始 的寡核苷酸带有自由的 3羟基。
纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。 常用的纯化方法有：C18
定量：根据寡核苷酸在260n m处的紫外吸收来定量。 储存：分装抽干。
Q3.合成的引物5'端是否有磷酸化? 合成的引物5为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行 5端磷酸化,
合成时直接在5或3端进行磷酸化，需要另外收费。
Q4.需要什么级别的引物? 根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 应用 引物长度要求 纯度级别要求
一般PCFT增 HEPD < 60base
OPC PAG罰 HPLC
或者要求我们
>60 base P AGE
诊断PCFT增 HEPD,PAGE < 40base
HEPD DNA测序 20base左右 HEPD, PAGE，HPLC 亚克隆，点突变等 根据实验要求定
HEPDPAGE 基因构建（全基因合成） 根据实验要求定
HEPDPAGE 反义核酸 根据实验要求定 P AGE, HPLC 修饰引物 根据实验要求定
Q5.需要合成多少OD数? 根据实验目的确定。一般 PCR扩增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。
或退火后做连接，1 OD就足够了。
如果是做基因拼接
Q6.如何计算引物的浓度? 引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成 100pmol/ul，称为保存
浓度，而引物的工作浓度一般配制成 10-5 0pm ol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的 体积，也可按下列方式计算:
V （微升）=OD数x 33 x 10000 / 引物的分子量
引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意:
1 OD260= 33 ug/ml o
溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物 OD数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以
根据生产记录查到实际产量是多少。 Q7.如何计算引物的Tm值?
引物设计软件都可以给出 Tm与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。 长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4 C(G + C)+ 2 C(A + T)
对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为:
Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) -600/size
*公式中，Size =引物长度。
Q8.引物(含修饰)的分子量是如何确定的?
非修饰的引物的分子量(MW在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个
碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数x碱基的平均分子量，或按下列公式计算
MW=NA * WA)
+ (NC * WC) + (NG * WG) + (NT * WT) +(Nmod * Wmod) + (Nx * Wx)+( NI* Wl) +16* Ns - 62. NA, NG, NC, NT, NI分别为引物中碱基 A或G或C或T或I的数量，WA, WG ,WC, WT, Wl分别为引物中碱
基A或G或C或T或I的分子量，Nmod Wmo分别为修饰基团的数目和分子量。对于混合碱基的分子量为
混合碱基的分子量总合除以混合数，例如 G+A混合的分子量为(313.21+329.21 ) /2 = 321.21 o Ns为硫代
数目，硫代每个位置增加分子量 16o
常规碱基分子量
Base
A
C
G
T
I
U
常规修饰基团分子量
5' -Biotin
5' -(6 FAM)
5' -HEX
Molecular Weight 313.21 289.18 329.21 304.19 314.2 290.17 405.45 537.46 744.13 3' -TAMARA 3' -Dabsyl 3' -(6 FAM) 623.60 498.49 569.46
5' -TET 675.24 3' -Amino Modifier C3 153.07 5' -Cy5 533.63 3' -Amino Modifier C7 209.18
5' -Cy3 507.59 3' -Thiol Modifier C3 154.12
Q9.如何溶解引物?
干燥后的引物质地非常疏松，开盖前最好瞬时离心一下，或管垂直向上在桌面上敲敲，将引物粉末收集到
管底。根据计算出的体积加入去离子无菌水或 TE(pH8.0)缓冲液，室温放置几分钟，振荡助溶，离心将溶 液收集到管底。溶解引物用的水一般不要用蒸馏水，因为有些蒸馏水的 pH值比较低(PH4-5),引物在这种
条件下不稳定。
Q10.如何保存引物?
引物合成后，经过一系列处理和纯化步骤，旋转干燥而成无色或白色絮状干粉。
干粉：运输时常温运输，-20 C可以保存一年。 储存液：配好后分装成几管，避免反复冻融，
-20 C可以保存半年。
工作液：常规使用，4 C保存，也可-20 C保存，但应避免反复冻融。 修饰荧光引物： 需要避光保存，尽快使用为宜。
Q11.引物定量不准是怎么回事儿?
我们偶尔收到用户投诉定量不准的报告，出现这种情况的可能性有：
1 ）定量错误、分装错误、引物抽干或收样过程中意外丢失。这种可能性有，但是很少，因为作为专业的 引物合成公司，我们的生产
人员都是经过严格的专业培训，这种错误是要求谨慎避免甚至杜绝的。一般情 况下，引物都有留样备份，接到用户投诉后，我们都会找出留样重新定量，一般都没有问题，如确实存在 问题，则可安排重新准备一份。
2）系统误差，我们认为 10%左右为允许误差。使用过程中，引物工作浓度范围很宽，定量上的少许偏差
不影响实验。
3）用户收到引物干粉时，打开引物管盖前没有离心或其他误操作导致引物干粉部分丢失。
（4）用户没有能够正确理解引物 OD数的含义，没有能够正确使用分光光度计，特别是使用微量测定；用
户没有将0D读数，正确地转换成母液中
例如，验证标20D引物量是否准确,
0D数。这种情况比较常见。 简单的做法是： 加入1ml水，彻底溶解混匀后，取100ul,加入900ul260nm,此时光吸收的读数为0.2。
水，用光径为1cm的石英比色杯，波长
Q12.最长可以合成多长的引物?
我们合成过 100base 的引物，但是产率很低。除非需要，建议合成片段长度不要超过 80base。引物越长, 出现问题的概率就越大，按照目前的引物合成效率，大于 80base的粗产品，全长引物的百分比不高，后续
处理还有丢失很多，最后的产量很低。 Q13.为什么修饰引物的产量要比一般引物低，价格要高
主要因为是修饰单体稳定性较差，偶连时间长，效率低，最后得到的产量自然低于一般的引物。修饰引物
通常需要PAGE或 HPLC纯化，纯化过程损失大。修饰引物使用的原料是一般引物原料的几百倍，所以产品
的价格也高。
Q14.引物片段退火后不能连接到载体上是什么问题? 连接反应需要引物的 5'磷酸基团。如果需要将合成的引物退火直接连接相应的载体上，引物需要磷酸化。
磷酸化的产物如果还不能连接载体上，需要检查载体的酶切效果，需要改善引物退火的条件。 SiRNA 分子
具有特殊的对称结构，退火的难度较大，退火时需要提高退火温度。 Q15.如果测序发现引物突变，是否有补偿？该如何处理?
如果出现测序发现引物位置碱基错误的情况，我们可以免费重合一次，没有其他任何补偿或赔偿，不承担
其他连带责任，这是国际行规。原因我们在前面已提到，化学合成效率不可能达到 100%。
如果遇到这种情况，首先和我们联系，我们会检查合成序列是否和原始订单一致，如果确认引物合成序列
没有输错，我们建议重新挑取克隆测序，您可能会找到正确克隆的。根据我们经验， 40个碱基以下的引物， 测1-2个克隆就可以了； 40个以上的特别是用于全片段拼接合成的，就需要多测一些了。一般情况下，每个
克隆突变的位点都不一样，正确的总是有的，就是如何找到它。您也可以要求我们将引物免费重合一次，
不过重合的引物和第一次的引物一样，都可能含突变，不会因为重合的引物就减少您的遇到问题的几率。
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