(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 CN 110093349 A(43)申请公布日 2019.08.06
(21)申请号 201910375501.0(22)申请日 2019.05.07
(71)申请人 华中农业大学
地址 430000 湖北省武汉市洪山区狮子山
街1号(72)发明人 李昌焱 李威 林拥军 马伟华 (74)专利代理机构 北京高沃律师事务所 11569
代理人 刘奇(51)Int.Cl.
C12N 15/113(2010.01)C12N 15/82(2006.01)C12N 5/10(2006.01)A01H 5/00(2018.01)A01H 6/46(2018.01)
权利要求书1页 说明书9页序列表7页 附图5页
CN 110093349 A(54)发明名称
利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA及应用(57)摘要
本发明提供了一组利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA及其应用，属于植物基因工程技术领域。本发明所述sgRNA包括g1RNA和g2RNA；所述g1RNA的核苷酸序
所述g2RNA的核苷酸序列列如SEQ?ID?NO.1所示；
如SEQ?ID?NO.2所示。利用本发明提供的sgRNA组合构建得到的重组表达载体转染水稻植株，能特异性地将xal3基因的启动子区域149nt进行缺失，从而使水稻体内xal3基因失去被白叶枯病菌诱导表达的能力，使缺失该启动子片段的转基因水稻对白叶枯病菌表现出抗性。另外，本发明提供的方法不影响转基因水稻的其他性状，转基因水稻育性良好。
CN 110093349 A
权 利 要 求 书
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1.一组利用CRISPR/Cas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA包括g1RNA和g2RNA；所述g1RNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示；所述g2RNA的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示。
2.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以pYLCRISPR/Cas9-MH为基础，包括依次串联的Cas9基因、U3启动子、权利要求1所述g1RNA、U6a启动子和权利要求1所述g2RNA。
3.根据权利要求2所述的重组表达载体，其特征在于，所述Cas9基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示；所述U3启动子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示；所述U6a启动子的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.5所示。
4.根据权利要求2或3所述的重组表达载体，其特征在于，所述U3启动子通过靶点接头T1与g1RNA连接；所述靶点接头T1由Pxal3U3-F和Pxal3U3-R变性退火制得；所述Pxal3U3-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示；所述Pxal3U3-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示。
5.根据权利要求2或3所述的重组表达载体，其特征在于，所述U6a启动子通过靶点接头T2与g2RNA连接；所述靶点接头T2由Pxal3U6a-F和Pxal3U6a-R变性退火制得；所述Pxal3U6a-F的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.8所示；所述Pxal3U6a-R的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.9所示。
6.一种用于生产无转基因痕迹的高抗白叶枯且育性正常的水稻的转基因水稻细胞，其特征在于，所述转基因水稻细胞中含有并能阳性表达权利要求2～5任意一项所述重组表达载体。
7.权利要求1所述g1RNA和g2RNA、权利要求2～5任意一项所述重组表达载体或权利要求6所述转基因水稻细胞在生产无转基因痕迹的高抗白叶枯且育性正常的水稻中的应用。
8.一种无转基因痕迹的高抗白叶枯且育性正常的水稻生产方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将权利要求2～5任意一项所述重组表达载体转化到水稻细胞中，得到转化细胞；(2)以所述转化细胞为原料，培养得到再生植物；
(3)利用PCR检测技术对所述再生植物进行阳性筛选，得到无转基因痕迹的高抗白叶枯且育性正常的水稻。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述水稻细胞为粳稻ZH11的细胞。10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述PCR检测的目的基因为所述重组表达载体自带的标记基因。
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CN110093349A利用CRISPRCas9系统特异性剪切水稻xal3基因启动子的sgRNA - 图文
