重组DNA技术
遗传工程也叫基因工程(gene engineering)基因操作(gene manipulation)或重组DNA技术
(recombination DNA technique)就是20世纪70年代以后兴起的一门新技术其主要原理就是用人工的方法把生物的遗传物质通常就是脱氧核糖核酸(DNA)分离出来在体外进行基因切割连接重组转移与表达的技术基因的转移已经不再限于同一类物种之间动物植物与微生物之间都可进行基因转移改变宿主遗传特性创造新品种系或新的生物材料
基因工程就是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术,一般包括4个步骤
:一就是克隆目的基因,取得所需要的·DNA特异片段;二就是将目的基因与DNA载体连接成重组DNA;三就是将重组DNA引入细菌或动植物细胞内使其增殖;四就是将表达目的基因的受体细胞挑选出来,使目的基因表达相应的蛋白质或其她产物,从而育成动植物优良新品种(系)。 自1977年成功地用大肠杆菌生产出生长Itl释放抑制因子以来,人胰岛素、人生长激素、胸腺肽、干扰素、尿激酶、肿瘤坏死因子、疯牛病疫苗、乙型肝炎病毒疫苗、甲型肝炎病毒疫苗、幼畜腹泻疫苗与青霉素酰化酶基因工程菌株等数十种基因工程产品相继问世。优质产毛羊等动物新品种,金色水稻,抗虫或抗除草剂的玉米、大豆、棉花、水稻,转类胡萝卜素生物合成相关酶基因花卉、蔬菜等已获推广或已取得阶段性成果。
广义的遗传工程包括细胞水平上的遗传操作(细胞工程)与分子水平上的遗传操作,即重组DNA技术(有人称之为基因工程)。狭义的遗传工程则专指后者。 简史
重组DNA技术来源于两个方面的基础理论研究--限制性核酸内切酶(简称限制酶)与基因载体(简称载体)。限制酶的研究可以追溯到1952年美国分子遗传学家S、E、卢里亚在大肠杆菌中所发现的一种所谓限制现象--从菌株甲的细菌所释放的噬菌体能有效地感染同
重组DNA技术
重组DNA技术
重组DNA技术
一菌株的细菌,可就是不能有效地感染菌株乙;少数被感染的菌株乙的细菌所释放的同一噬菌体能有效地感染菌株乙可就是不能有效地感染菌株甲。经过长期的研究,美国学者W、阿尔伯在1974年终于对这一现象提出了解释,认为通过噬菌体感染而进入细菌细胞的DNA分子能被细菌识别而分解,细菌本身的DNA则由于已被自己所修饰(甲基化)而免于被分解。但有少数噬菌体在没有被分解以前已被修饰了,这些噬菌体经释放后便能有效地感染同一菌株的细菌。被甲(或乙)这一菌株所修饰的噬菌体只能有效地感染甲(或乙),而不能有效地感染乙(或甲),说明各个菌株对于外来DNA的限制作用常常就是专一性的。通过进一步的研究发现这种限制现象就是由于细菌细胞中具有专一性的限制性核酸内切酶的缘故。
重组DNA技术中所用的载体主要就是质粒与温与噬菌体(见转导)两类,而在实际应用中的载体几乎都就是经过改造的质粒或温与噬菌体。英国微生物遗传学家W、海斯与美国微生物遗传学家J、莱德伯格等在1952年首先认识到大肠杆菌的F因子(见细菌接合)就是染色体外的遗传因子。1953年法国学者P、弗雷德里克等发现大肠杆菌产生大肠杆菌素这一性状为一种染色体外的大肠杆菌素因子所控制。1957年日本学者发现了抗药性质粒。后两类质粒都就是在遗传工程中广泛应用的质粒。
重组DNA技术中广泛应用的噬菌体就是大肠杆菌的温与噬菌体λ,它就是在1951年由美国学者E、莱德伯格等发现的。
到70年代初,生物化学研究的进展也为重组DNA技术奠定了基??972年美国的分子生物学家P、伯格等将动物病毒SV40的DNA与噬菌体P22的DNA连接在一起,构成了第一批重组体DNA分子。1973年美国的分子生物学家S、N、科恩等又将几种不同的外源DNA插入质粒pSC101的DNA中,并进一步将它们引入大肠杆菌中,从而开创了遗传工程的研究。 步骤与方法 折叠步骤
重组DNA技术一般包括四步:①获得目的基因;②与克隆载体连接,形成新的重组DNA分子;③用重组DNA分子转化受体细胞,并能在受体细胞中复制与遗传;④对转化子筛选与鉴定。;⑤对获得
重组DNA技术
外源基因的细胞或生物体通过培养,获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。在具体工作中选择哪条技术路线主要取决于基因的来源、基因本身的性质与该项遗传工程的目的。 折叠方法
重组DNA片段的取得主要的方法有:
①利用限制酶取得具有粘性末端或平整末端的DNA片段;
②用机械方法剪切取得具有平整末端的DNA片段,例如用超声波断裂双链DNA分子;
③经反向转录酶的作用从mRNA获得与mRNA顺序互补的DNA单链,然后再复制形成双链DNA(cDNA)。例如人的胰岛素与血红蛋白的结构基因都用这方法获得。这样获得的基因具有编码蛋白质的全部核苷酸顺序,但往往与原来位置在染色体上的基因在结构上有区别,它们不含有称为内含子的不编码蛋白质的间隔顺序(见基因);
④用化学方法合成DNA片段。从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码。依照这密码用化学方法可以人工合成基因。
重组DNA技术技术路线
重组DNA技术技术路线
DNA片段与载体的连接 DNA片段与载体相连接的方法主要有四种:
①粘性末端连接,每一种限制性核酸内切酶作用于DNA分子上的特定的识别顺序,许多酶作用的结果产生具有粘性末端的两个DNA片段。例如来自大肠杆菌(Escherichia coli)的限制酶EcoRI作用于识别顺序↓…GAATTC… …CTTAAG…↑(↑指示切点),产生具有粘性末
端…G …CTTAA与AATTC… G…的片段。把所要克隆的DNA与…载体DNA用同一种限制酶处理后再经DNA连接酶处理,就可以把它们连接起来。
②平整末端连接,某些限制性内切酶作用的结果产生不含粘性末端的平整末端。例如来自副流感嗜血杆菌(Hemophilus parainfluenzae)的限制酶Hpal作用于识别顺序
↓…GTTAAC… …CAATTG…而产生末端为…GTT …GAA的DNA片段。用机械剪切方法取得的DNA片段的末端也就是平整的。在某些连接酶(例如感染噬菌体T4后的大肠杆菌所产生的DNA连接酶)的作用下同样可以把两个这样的DNA片段连接起来。
重组DNA技术
