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（十四）、探针的种类和优缺点？ 答：1、cDNA探针：通过逆转录获得cDNA后，将其克隆于适当的克隆载体，通过扩增重组质粒而使cDNA得到大量的扩增。提取质粒后分离纯化作为探针使用。它是目前应用最为广泛的一种探针。
2、基因组探针：从基因组文库里筛选得到一个特定的基因或基因片段的克隆后，大量扩增、纯化，切取插入片段，分离纯化为探针。
3、寡核苷酸探针：根据已知的核酸顺序，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段作为探针。 4、RNA探针：采用基因克隆和体外转录的方法可以得到RNA或反义RNA作为探针。 （十五）、探针的标记法？
答：1、缺口平移法：此法是利用适当浓度的DNase Ⅰ在DNA双链上随机切割单链，造成单链切口。切口处产生一个5末端和3末端，3末端就可以作为引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的催化下，以互补的DNA单链为摸板，依次将dNTP连接到切口的3末端的羟基上，合成新的DNA单链；同时DNA聚合酶Ⅰ的5→3的核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除，新合成链不断延伸，从而使原DNA分子上的部分核苷酸残基被标记的核苷酸所取代。
2、随机引物法：随机引物是人工合成的长度为6个寡核苷酸残基的寡聚核苷酸片段的混合物。对于任何一个用作探针的DNA片段，随机引物混合物中都会有一些六核苷酸片段可以与之结合，起到DNA合成引物的作用。将这些引物与变性的DNA单链结合后，以4种dNTP（其中一种是标记物标记的dNTP）为底物，合成与探针DNA互补的切带有标记物的DNA探针。 3、PCR标记法：在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标记的dNTP， 这样标记的dNTP就在PCR反应的同时掺入到新合成的DNA链上。
4、末端标记法：只是将DNA片段的一端进行标记。 （十六）、PCR的基本原理？
答：PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理是依据细胞内DNA半保留复制的机理，以及体外DNA分子于不同温度下双链和单链可以互相转变的性质，人为地控制体外合成系统的温度，以促使双链DNA变成单链，单链DNA与人工合成的引物退火，然后耐热DNA聚合酶以dNTP为原料使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。PCR全过程每一步的转换是通过温度的改变来控制的。需要重复进行DNA模板解链、引物与模板DNA结合、DNA聚合酶催化新生DNA的合成，即高温变性、低温退火、中温延伸３个步骤构成PCR反应的一个循环，此循环的反复进行，就可使目的DNA得以迅速扩增。DNA模板变性：模板双链DNA?单链DNA，94℃。退火：引物＋单链DNA?杂交链，引物的Tm值。引物的延伸：温度至70 ℃左右， Taq DNA聚合酶以４种dNTP为原料，以目的DNA为模板，催化以引物３’末端为起点的5’→3’DNA链延伸反应，形成新生DNA链。新合成的引物延伸链经过变性后又可作为下一轮循环反应的模板PCR，就是如此反复循环，使目的DNA得到高效快速扩增。 （十七）、PCR引物设计的基本要求？
答：1、引物长度一般为15～30个核苷酸。过短影响PCR的特异性，过长会提高相应退火温度，使延伸温度超过TaqDNA聚合酶最适温度74℃,影响产物的生成。
2、引物的碱基尽可能随机，避免出现嘌呤、嘧啶碱基堆积现象。3’端不应有连续3个G和C。否则会使引物和模板错误配对。G+C含量一般占45％ -55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值计算公式：Tm＝4(G+C)+ 2(A+T)
3、引物自身不应存在互补序列以避免折叠成发夹结构。引物的连续互补序列，一般不超过3bp。 4、两个引物之间不应存在互补序列，尤其应避免3’端的互补重叠。
5、引物与非特异扩增区的序列的同源性不超过70％，引物3’末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。
6、引物3’端碱基是引发延伸的起点，因此一定要与模板DNA配对。引物3’端最佳碱基选择是G和C，形成的碱基配对比较稳定。
7、引物与模板结合时，引物的5’端最多可以游离十几个碱基而不影响PCR反应的进行。
8、引物的5’端可以修饰，如附加限制酶位点，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入
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其它短序列包括起始密码子、终止密码子等。 （十八）、PCR的反应条件？ 答：1、PCR反应的缓冲液：
? Tris-HCl缓冲液
? KCl 促进引物的退火，浓度太高时会抑制Taq DNA聚合酶活性。 ? 加入BSA或明胶有利于保护TaqDNA聚合酶活性。
? 必要时加入适量二甲基亚砜(DMSO)或甲酰胺利于破坏模板二级结构，提高PCR反应特异性。 2、镁离子浓度 一般用量1.5-2.0 mmol/L，Taq DNA聚合酶活性需要Mg 2+。Mg 2+浓度过低，会显著降低酶活性。Mg 2+浓度过高又使酶催化非特异性扩增增强。Mg 2+浓度还会影响引物的退火、模板与PCR产物的解链温度，从而影响扩增片段的产率。
3、底物浓度 工作浓度20-200umol/L， dNTPs浓度过高可加快反应速度，也增加碱基的错配率和实验成本。降低浓度会导致反应速度下降，可提高反应的特异性。在PCR反应中，4种dNTP必须以等摩尔浓度配制，以减少PCR反应的错配误差并提高使用效率。
4、Taq DNA聚合酶 75-80℃时具有最高的聚合酶活性，150个核苷酸/秒；具有良好的热稳定性，95℃仍有活性，应用浓度一般为1-2.5u/100ul反应体积。
5、引物 0.1-0.5umol/L。引物浓度偏高会引起错配或非特异性扩增、生成引物二聚体，使目的DNA片段产率下降。退火温度与引物Tm值有关，引物Tm值在55-80 ℃ 范围较为理想。 6、反应温度和循环次数 （十九）、影响大肠杆菌系统外源基因表达的因素？
答：1、启动子的强弱；2、基因的剂量；3、影响RNA转录和翻译效率的因素：SD序列、mRNA；4、外源基因密码子的选择；5、表达产物的大小；6、表达产物的稳定性。 （二十）、大肠杆菌系统表达外源基因必须具备的条件？ 答：1、要求外源基因的编码区不能含有内含子；
2、表达的外源片段要位于大肠杆菌启动子的下游，并形成正确的阅读框架；
，
3、转录出的mRNA必须有与大肠杆菌16S rRNA3末端相匹配的SD序列，才能被有效的翻译成蛋白质。 4、蛋白产物必须稳定，不易被细胞内蛋白酶快速降解，且对宿主无害。 （二十一）、真核细胞表达外源基因的条件？
答：1、首先必须具备哺乳动物细胞表达的功能元件。要求哺乳动物细胞表达载体带有能在真核细胞中表达外源基因的真核转录调控元件；
2、注意选择转染的受体细胞，不同类型的细胞具有不同的特性； 3、注意选择适当的选择标记。 （二十二）、转基因动物的概念、原理及应用？
答：1、概念：是指用人工方法将外源基因导入或整合到基因组内，并能稳定传代的一类动物。它的特点是“分子及细胞水平操作，组织及动物整体水平表达”。 2、基本原理：将目的基因或基因组片段用显微注射等方法注入实验动物的受精卵或着床前的胚胎细胞中，使目的基因整合到基因组中，然后将此受精卵或着床前的胚胎细胞再植入受体动物的输卵管或子宫中，使其发育成携带有外源基因的转基因动物，人们可以通过分析转基因和动物表型的关系，揭示外源基因的功能；也可以通过转入外源基因培育优良的动物品种。
3、应用：建立用于研究外源基因表达调控体系；建立医学中常用的疾病模型；培育动物新品种；药理学和药用蛋白的生产研究。 （二十三）、基因敲除的基本程序？
答：通过DNA同源重组，使得胚胎干细胞特定的内源基因被破坏而造成功能丧失，然后通过胚胎干细胞介导得到该基因丧失的小鼠模型的过程称为基因敲除。
1、 打靶载体的构建：同源序列要足够长，要含有筛选用的标志基因。 2、 胚胎干细胞的体外培养
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3、 打靶载体导入胚胎干细胞 4、 同源重组胚胎干细胞的筛选 5、 基因敲除胚胎干细胞注射入胚泡 6、 胚泡植入假孕小鼠的子宫中
7、 杂交育种获得纯合的基因敲除动物 （二十四）、DNA芯片的原理？
答：DNA芯片技术就是一种大规模的集成的固相核酸分子杂交，以大量已知碱基序列的寡核苷酸片段为探针，检测样品中哪些核酸序列与其互补，然后通过定性定量分析得出待测样品的基因序列及表达的信息。其方法包括芯片的制备、样品的准备、分子杂交和检测分子。 （二十五）、诱变剂的作用机制？ 答：1、碱基的类似物诱发突变 2、改变DNA的化学结构
3、结合到DNA分子上诱发移码突变
4、紫外线及其他射线引起的DNA分子的变化 （二十六）、突变类型及其遗传效应？ 答：1、突变类型：
① 点突变：DNA大分子上一个碱基的变异。分为转换和颠换。 ② 缺失：一个碱基或一段核苷酸链从DNA大分子上消失。 ③ 插入：一个原来没有的碱基或一段原来没有的核苷酸链插入到DNA大分子中间。 ④ 倒位：DNA链内重组，使其中一段方向倒置。 2、突变的遗传效应：
①遗传密码的改变：错义突变、无义突变、同义突变、移码突变
② 对mRNA剪接的影响：一是使原来的剪接位点消失；二是产生新的剪接位点。 ③ 蛋白质肽链中的片段缺失： （二十七）、基因治疗的策略？
答：1、基因置换或称基因矫正：特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，让导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因，不涉及基因组的任何改变。
2、基因添加或称基因增补：通过导入外源基因使靶细胞表达其本身不表达的基因。
3、基因干预：采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因而使之不能表达，以达到治疗疾病的目的。
4、 基因标记：基因标记实验是基因治疗的前奏，并不在于直接治疗疾病而是期望能够提供有关正常细
胞生物学和疾病病理方面的信息。
（二十八）、基因诊断常用的生物学技术。 （二十九）、简述重组DNA技术的过程。
蛋白质的生物合成 (一)名词解释
1．翻译 2．密码子 3．密码的简并性 4．同义密码子 5．变偶假说 6．移码突变 7．同功受体 8．多核糖体
(二)问答题
1．参与蛋白质生物合成体系的组分有哪些?它们具有什么功能? 2．遗传密码是如何破译的? 3．遗传密码有什么特点?
4．简述三种RNA在蛋白质生物合成中的作用。
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5．简述核糖体的活性中心的二位点模型及三位点模型的内容。 6．氨基酸在蛋白质合成过程中是怎样被活化的? 7．简述蛋白质生物合成过程。
8．蛋白质合成中如何保证其翻译的正确性?
9．原核细胞和真核细胞在合成蛋白质的起始过程有什么区别。 10．蛋白质合成后的加工修饰有哪些内容? 11．蛋白质的高级结构是怎样形成的?
12．真核细胞与原核细胞核糖体组成有什么不同?如何证明核糖体是蛋白质的合成场所?
13. 已知一种突变的噬菌体蛋白是由于单个核苷酸插入引起的移码突变的，将正常的蛋白质和突变体蛋白质用胰蛋白酶消化后，进行指纹图分析。结果发现只有一个肽段的差异，测得其基酸顺序如下： 正常肽段 Met-Val-Cys-Val-Arg 突变体肽段 Met-Ala-Met-Arg
（1）什么核苷酸插入到什么地方导致了氨基酸顺序的改变？ （2）推导出编码正常肽段和突变体肽段的核苷酸序列. 提示：有关氨基酸的简并密码分别为
Val: GUU GUC GUA GUG Arg: CGU CGC CGA CG AGA AGG Cys: UGU UGC Ala: GCU GCC GCA CGC 14. 试列表比较核酸与蛋白质的结构。 15. 试比较原核生物与真核生物的翻译。 (三)填空题
1．蛋白质的生物合成是以___________为模板，以___________为原料直接供体，以_________为合成杨所。 2．生物界共有______________个密码子，其中___________个为氨基酸编码，起始密码子为_________；终止密码子为_______、__________、____________。
3．原核生物的起始tRNA以___________表示，真核生物的起始tRNA以___________表示，延伸中的甲硫氨酰tRNA以__________表示。
4．植物细胞中蛋白质生物合成可在__________、___________和___________三种细胞器内进行。 5．延长因子T由Tu和Ts两个亚基组成，Tu为对热___________蛋白质，Ts为对热________蛋白质。 6．原核生物中的释放因子有三种，其中RF-1识别终止密码子_____________、____________；RF-2识别__________、____________；真核中的释放因子只有___________一种。 7．氨酰-tRNA合成酶对__________和相应的________有高度的选择性。 8．原核细胞的起始氨基酸是_______，起始氨酰-tRNA是____________。
9．原核细胞核糖体的___________亚基上的 __________协助辨认起始密码子。
l0．每形成一个肽键要消耗_____________个高能磷酸键，但在合成起始时还需多消耗___________个高能磷酸键。
11．肽基转移酶在蛋白质生物合成中的作用是催化__________形成和_________的水解。
12．肽链合成终止时，___________进人“A”位，识别出_________，同时终止因子使________的催化作用转变为____________。
13．原核生物的核糖体由____________小亚基和____________大亚基组成，真核生物核糖体由_________小亚基和_______________大亚基组成。
14. 蛋白质中可进行磷酸化修饰的氨基酸残基主要为_____________、____________、___________。 (四)选择题
1．蛋白质生物合成的方向是( )。
①从C→N端 ②定点双向进行 ③从N端、C端同时进行 ④从N→C端 2．不能合成蛋白质的细胞器是( )。
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①线粒体 ②叶绿体 ③高尔基体 ④核糖体 3．真核生物的延伸因子是( )。
①EF—Tu ②EF一2 ③EF--G ④EF一1 4．真核生物的释放因子是( )。
①RF②RF一1 ③RF一2 ④RF一3
5．能与tRNA反密码子中的I碱基配对的是( )。 ①A、G ②C、U ③U ④U、C、A 6．蛋白质合成所需能量来自( )。 ①ATP ②GTP ③ATP、GTP ④GTP 7．tRNA的作用是( )。
①将一个氨基酸连接到另一个氨基酸上 ②把氨基酸带到mRNA位置上 ③将mRNA接到核糖体上 ④增加氨基酸的有效浓度 8．关于核糖体的移位，叙述正确的是( )。
①空载tRNA的脱落发生在“A”位上 ②核糖体沿mRNA的3’→5’方向相对移动 ③核糖体沿mRNA的5’→3’方向相对移动
④核糖体在mRNA上一次移动的距离相当于二个核苷酸的长度 9．在蛋白质合成中，下列哪一步不需要消耗高能磷酸键( )。 ①肽基转移酶形成肽键 ②氨酰一tRNA与核糖体的“A，’位点结合 ③核糖体沿mRNA移动
④fMet—tRNAf与mRNA的起始密码子结合以及与大、小亚基的结合 10．在真核细胞中肽链合成的终止原因是( )。
①已达到mRNA分子的尽头 ②具有特异的tRNA识别终止密码子 ③终止密码子本身具有酯酶作用，可水解肽酰与tRNA之是的酯键 ④终止密码子被终止因子(RF)所识别
11．蛋白质生物合成中的终止密码是( )。 ①UAA ②UAU ③UAC ④UAG⑤UGA
12．根据摆动假说，当tRNA反密码子第1位碱基是I时，能够识别哪几种密码子( ) ①A ②C ③G ④T ⑤U
13．下列哪些因子是真核生物蛋白质合成的起始因子( )。 ①IF1 ②IF2 ③eIF2 ④eIF4 ⑤elF4A
14．蛋白质生物合成具有下列哪些特征( )。
①氨基酸必须活化 ②需要消耗能量 ③每延长一个氨基酸必须经过进位、转肽、移位、税落四个步骤 ④合成肽链由C端向N端不断延长 ⑤新生肽链需加工才能成为活性蛋白质 15．下列哪些内容属于蛋白质合成后的加工、修饰( )。
①切除内含子，连接外显子 ②切除信号肽 ③切除N-端Met ④形成二硫键 ⑤氨的侧链修饰
16．蛋白质生物合成过程中，下列哪些步骤需要消耗能量( )。
①氨基酸分子的活化 ②70S起始复合物的形成 ③氨酰tRNA进入核糖体A位 ④肽键形成 ⑤核糖体移位
17．原核生物的肽链延伸过程有下列哪些物质参与( )。
①肽基转移酶 ②鸟苷三磷酸 ③mRNA ④甲酰甲硫氨酰-tRNA ⑤EF-Tu、EF-Ts、 EF-G
18.Shine-Dalgarno顺序(SD-顺序)是指: ( )
①在mRNA分子的起始码上游8-13个核苷酸处的顺序 ②在DNA分子上转录起始点前8-13个核苷酸处的顺序
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0101分子生物学总复习题答案
