最近看到一本书《环境基因组学实验指南》其中第十七章题目为“16S rRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群”，它作为一个实验技术写进实验书里，比看期刊，论文更有所帮助。我将这一章编写的内容全部敲下来给你，希望对你的实验有所启示和帮助。
第十七章16S rRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群
概论
过去几十年中，利用所谓的生物标记物来检测环境样本中的微生物菌群的分子微生物生态学（molecular microbial ecology）得到了快速的发展。许多分子可以作为生物标记物，包括细胞壁成分、蛋白质、脂类、DNA或RNA，尤其是核糖体RNA（rRNA）小亚基和相应基因的应用在微生物生态学的发展中发挥了重要的作用。目前已经建立了几种应用于环境样本中的微生物群落的指纹特征分析方法，其中最常用的方法是PCR扩增片段的变性梯度凝胶电泳（denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE），DGGE可以根据序列将相同长度的DNA片段混合物分开，分离的原理使基于DNA片段在含有梯度变性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配置的聚丙烯酰胺凝胶中的序列特异性融点不同实现的。DGGE能对微生物群落进行快速的分析和比较，利用DGGE可使组成的多样性一目了然，其中每一条带原则上代表一种细菌系群，染色后，在凝胶中DNA分子停止迁移的位置会看到条带，理论生，DGGE指纹图谱可以区分一个碱基对的差别。 关键词：食本芽孢杆菌（Bacillus benzoevorans）；DGGE；指纹图谱；16S rRNA基因；土壤微生物
1. 引言
微生物菌群对于地球上甚至地球外的几乎所有环境的发展和功能是至关重要的，而针对一系列细胞生物标记物的分子微生物生态学方法的长足发展，使得对微生物群落组成和功能的检测可以不依赖于微生物的培养（1，2）。靶向生物标记物可以是在不同的分类水平表明特定微生物种存在的任何生物成分，包括细胞成分如细胞壁成分、蛋白质、脂类、DAN或RNA。即使细胞死亡后这些分子仍可以被检测到。这使得我们可以研究微生物群落并追踪其在不断变化的环境条件下的发展过程，所以包括历史标本，储存的样本（风干保存用于后续分析的样本）甚至考古样本这些不可能用培养的方法获得微生物的材料都可以得到研究（3-5）。微生物生态学可以很方便的应用核糖体RNA小亚基（SSU rRNA；细菌和古细菌的16S rRNA，真核生物的18S rRNA）和对应的基因作为生物标记物。以这些分子作为靶点，可以利用很多互为补充的分子技术来检测不同环境下总的细菌、古细菌和真核生物群落，以及特定的感兴趣的微生物种类。多以SSU rRNA基因检测作为普遍的系统发育标记物的分子指纹图谱方法，常被用于在分子微生物生态学中快速检测不同时间或空间中微生物群落组分的变化，结合数理统计分析，这些技术是研究不断变化的环境因子如何影响微生物群落构成的有力工具（6,7）。
几种类型的梯度凝胶电泳已经被有效地应用于环境样本中微生物群落的观察。最常用的是变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（temperature gradient gel electrophoresis，TGGE），而最新出现的是结合了DGGE和TGGE的主要原理的时间温度梯度凝胶电泳。DGGE在微生物生态系统的首次应用是在对海洋生态系统中的细菌多样性分析（9）。凝胶电泳技术在快速比较不同环境中个微生物群落和检测某一特定的群落在不同时间多个成员内的组成变化的研究中非常有效。
DGGE是一种利用序列差异来分离同样长度DNA片段混合物的技术（10）。分离的原理是基于DNA片段在含有梯度变性化合物（通常是尿素和甲酰胺的混合物）配置的聚丙烯
酰胺凝胶澳中的序列特异性融点不同实现的，在5’端引入GC夹（GC-Clamp）可保护DNA片段不会完全变性。这个GC夹有30~50bp长，是在进行DGGE分析之前加到对靶基因进行PCR扩增的一个引物上的，理论上，在不长于500bp的PCR扩增产物上的单个碱基对差异都可以被鉴定出来，在变性梯度中，不同序列的片段将停留在不同的位置。
2. 材料
2.1 利用试剂盒（Fast DNA SPIN Kit）分离DNA
Fast DNA SPIN Kit（用于土壤）（Q BIOgene，Cambs，United Kingdom）是商品话的DNA分离试剂盒，在实验室中常用于广泛的环境介质检测，包括土壤、沉积物、排泄物。也可用于其它DNA分离方法。 2.2 PCR
PCR可以用Taq聚合酶在PCR仪上进行。 不加模板DNA，先准备基本组分：
1、5μL10×PCR缓冲液（10×缓冲液：200mmol/L Tris-HCl，pH8.4，500mmol/L KCl） 2、3μL MgCl2（50 mmol/L） 3、1μL上游引物（10 mmol/L） 4、1μL下游引物（10 mmol/L） 5、1μLdNTP（10 mmol/L）
6、0.25μLTaqDNA聚合酶（5U/μL） 7、37.75μLMilliQ水 共49μL的反应体积。
配制时将上面的每一组份乘以需要的反应次数，多加一份。分装在0.2mLPCR管（每管49μL）中，最后加入模板DNA（1μL）.每一反应中最终模板的量在10~100ng之间。将离心管放入PCR仪中，开始按设定的反应扩增。 2.3 DGGE
2.3.1 DGGE仪器设备部分
1、大小玻璃板
2、Gelbond（胶贴）
3、Bio-Rad DGGE设备，包括：
a．温度控制模块包括加热器、搅拌器、泵和电泳导线。 b．电泳槽 c．三明治芯 d．三明治夹 e．分隔条 f．梳子 4、电源
5、泵和混合槽 2.3.2 DGGE电泳
1、变性剂（100%变性剂、0%变性剂） 2、50×TAE缓冲液：242gTris，57.1mL冰乙酸，100mL0.5mol/LEDTA，pH8.0。 2.3.3 DGGE染色溶液
根据自己的选择用染色液对凝胶进行染色。
3. 方法
DGGE是在分子微生物生态学中建立的较完善的分子指纹图谱技术（11,12）。DGGE技术可以迅速地分析微生物群落。复杂的微生物群落可以利用DGGE达到可视化，理论上其中每一条带代表一细菌种系型，然而，此技术的缺陷在于只利用了非常有限的遗传信息（16S rRNA）。DGGE的原理使利用序列特异性将同样长度的PCR扩增产物分开。双链DNA在变性作用下解离。DNA在电场中向正极移动，在特意向序列（两条核苷酸链解离）决定的特定位置溶解。在扩增过程中，PCR产物的5’或者3’端引入了GC夹，以避免完全变性，最终形成的叉状结构实质上发挥了阻止迁移的作用。染色后，可以在DNA分子在凝胶中停留迁移的位置观察到条带。理论上，DGGE指纹图谱可以区分单个碱基对的差异。 3.1 DNA分离
DNA可用Fast DNA SPIN Kit（用于土壤）（Q BIOgene，Cambs，United Kingdom）直接从土壤中（或其他样本）按照说明书进行分离。这种试剂盒可高效裂解所有的微生物，包括原来比较难处理的如细菌芽孢和内孢子、革兰氏阳性细菌、酵母、藻类、线虫和真菌。 3.2 PCR程序
下面是针对表1的引物优化后的PCR循环参数，选择专门对应你处理的物种适合的程序。
1. 细菌群落DGGE-PCR： 预变性 变性 杂交 延伸 后延伸
2. 古细菌DGGE-PCR： 预变性 变性 杂交 延伸 后延伸
3. 原核菌群DGGE-PCR： 预变性 变性 杂交 延伸 后延伸 5min 30s 45s 130s 10 min 94℃ 94℃ 56℃ 72℃ 72℃ 35个循环 5min 30s 40s 1 min 5 min 94℃ 94℃ 52℃ 68℃ 68℃ 35个循环 2min 30s 40s 1 min 5 min 95℃ 95℃ 56℃ 72℃ 72℃ 35个循环 3.3 DGGE-PCR引物
表1提供了一组普遍的和种群特异性的DGGE-PCR引物（见注释3）。
表1 不同微生物菌群常用的DGGE-PCR引物 引物 细菌 Bact-968-GC-F 序列 参考 文献 （17） 5’-cgc ccg ggg ggc gcc ccg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg （17） gaa cgc gaa cct tac3’ L1401-R 5’-gcg tgt gta caa gac cc-3’ （18） Bact-0357-F-GC 5’-ccg ggg gcg cgc ccc ggg cgg ggc ggg ggc acg ggg ggc （18） cta cgg gag gca gca g-3’ Bact-0158-R 5’-att acc gcg gct gct gct-3’ （18） Bact-0954-F-GC 5’-cgc cgg ggg cgc gcc ccg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg （18） ggc aca agc ggt gga gca tgt gg-3’ Bact-1369-R 古细菌 Arch-109-F Uni-515-GC-R 真核生物 Euk1A Euk516r-GC 5’-gcc cgg gaa cgt att cac cg-3’ 5’-act gct cag taa cac gt-3’ （18） （19） 5’-cgc ccg ggg cgc gcc ccg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg （20） gat cgt att acc gcg gct gct ggc ac-3’ 5’-ctg gtt gat cct gcc ag-3’ （21） 5’-cgc ccg ggg cgc gcc ccg ggc ggg gcg ggg gca cgg ggg （21） gac cag act tgc cct cc-3’ 3.4 DGGE 3.4.1 凝胶“三明治”制备（见注释4）
1.用肥皂清洗大、小玻璃板，干燥后用95%乙醇清洗（见注释5）。 2.切除大小和大玻璃搅拌一样的胶贴（见注释6）。 3.在大玻板表面上加一些水。
4.将胶贴的疏水面放在玻板上（你可以滴一滴水在胶贴上来方便地检查疏水面，疏水面的水将滑落）。
5.用滚筒固定胶贴后移去纸保护层。 6.用纸巾轻轻吸干胶贴。
7.用95%乙醇清洗分隔条，并放于胶贴的左右两侧。 8. 将小玻板放在上方。
9.用夹子夹住玻板“三明治”，并放入“三明治支架” 10.按下衬垫，并拧紧压板的螺丝。
11.将玻璃“三明治”放在橡胶密封垫上，并按下手柄。 12.用移液器加入凝胶“塞”。 3.4.2 凝胶“塞”制备
在制备主要的分析梯度凝胶前，需在DGGE玻板盒底部做一个0%变性剂PAG凝胶“塞”——防治底部泄露。制备凝胶“塞”的主要方法如下：
1. 确保凝胶架处于水平；必要时调节底部的螺丝。 2. 如下制备“塞”溶液（一块凝胶体积）：
1.5mL 0%变性剂，8%PAG溶液 4.5μL TEMED 15μL 10%APS
3. 通过橡胶密封垫一边加入1mL“塞”溶液（见注释7）。 4. “塞”溶液放置10min。 5. 灌入梯度凝胶和浓缩胶。
3.4.3 制备凝胶
1.从低到高浓度梯度宁骄傲和浓缩胶按表2混合配制，操作在冰上进行（见注释8）。 2.用软化水清洗梯度制备仪和连接管道，打开泵（流速为19mL/min），抽干系统。
3.关闭梯度植被以各室之间的开关。 4.用纸巾吸干各室。
5.当凝胶溶液冷却后，加入10%APS至高浓度和低浓度的变性剂溶液。 6.在右室加入高浓度溶液，在左室加入低浓度溶液。
7.开始搅拌，打开开关，并立即启动泵保持流速4.5mL/min。 8.将针头放于两块玻璃板间。
9.当凝胶灌注结束后，关掉泵，转移至Erlenmeyer烧瓶。 10.用软化水清洗各室，启动泵抽干系统。 11.加10%APS到浓缩胶中。
12.关掉各室间的开关，在右室加入浓缩胶。
13.将针头放于两块玻璃板间，启动泵，保持流速为3 mL/min。
14.灌完浓缩胶后，插入梳子，让其凝固形成加样孔。避免气泡产生，否则会在条带中出现凹陷。
15.凝胶放置聚合1h。
表2 DGGE梯度混合比例表 梯度/% 0 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 0%(mL) 9 9.1 8.97 8.84 8.71 8,.58 8.45 8.32 8.19 8.06 7.93 7.8 7.67 7.54 7.41 7.28 7.15 7.02 6.89 6.76 6.63 6.5 6.37 6.24 6.11 5.98 5.85 100%(mL) - 3.9 4.03 4.16 4.29 4.42 4.55 4.68 4.81 4.94 5.07 5.2 5.33 5.46 5.59 5.72 5.85 5.98 6.11 6.24 6.37 6.5 6.63 6.76 6.89 7.02 7.15 终体积(mL) 9 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 TEMED(μL) 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 13 APS(μL) 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50 50
16S rRNA靶向变性梯度凝胶电泳指纹图谱分析微生物菌群
