. 实验三 微生物接种技术
一、实验目的
1、掌握无菌操作在微生物接种过程中的重要性。 2、掌握几种常用的微生物接种方法。 3、掌握微生物微生物扩大繁殖的基本方法。 4、认识微生物接种工具 二、实验原理
微生物接种技术是生物科学研究中最基本的操作技术。由于实验目的、培养基种类及容器等不同，所用接种方法不同，如斜面接种、液体接种、固体接种和穿刺接种等，以获得生长良好的纯种微生物。为此，接种必须在一个无杂菌污染的环境中进行严格的无菌操作；同时，因接种方法的不同，常采用不同的接种工具，如接种针、接种环、移液管和玻璃刮铲等。 三、实验器材
主要仪器及设备 无菌室、超净工作台、培养箱、振荡器、接种针、接种环、接种钩、接种铲，试管固体斜面培养基、培养基平板、三角瓶液体培养基，PDA平板及斜面，牛肉膏-蛋白胨-琼脂平板、斜面培养基、牛肉膏-蛋白胨液体培养基、试管半固体培养基。
菌种 大肠杆菌（Escherichia coli)、青霉(Penicillium sp．)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae Hansen)、细黄链霉菌(Streptomyces microflavus)放线菌等。 四、操作步骤
(一)斜面接种技术具体操作如下：
1、贴标签 接种前在试管上贴上标签，注明菌名、接种日期、接种人姓名等。贴在距试管口径2-3厘米的位置。 2、点燃酒精灯。
3、接种 用接种环将菌种移接到贴好标签的试管斜面上。无菌操作程序简述如下： ⑴手持试管 将菌种和用于接种的斜面两支试管用大拇指和其他四指握在左手中、使中指位于两试管之间。斜面向上，并使它们位于水平位置(图a)。 ⑵旋松棉塞 先用右手将棉塞旋松，以便接种时易于拔出。
⑶取接种环 右手拿接种环在火焰将环端烧红灭菌，然后将有可能伸入试管的其余部分，均用火烧过灭菌。
⑷拔棉塞 用右手的无名指、小指和手掌边先后拔出试管的棉塞，然后让试管口缓缓过火灭菌(切勿烧得过烫)，如图b、c所示。
⑸环冷却 将灼烧过的接种环伸入菌种管，先使环接触没有长菌的培养基部分，使其冷却。
⑹取菌种 待环冷却后轻轻沾取少量菌或孢子，然后将接种环移出接种管，如图d所示，注意不要使环的部分碰到管壁，取出后不可使环通过火焰。
⑺接种 在火焰旁迅速将沾有菌种的接种环伸入另一支待接斜面试管。从斜面培养基的
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. 底部向上部作“之” 字形来回划线，方向是从下部开始，一直划至上部，勿划破培养基(图e)。有时也可用接种针仅在斜面培养基的中央划一条线作斜面接种，以便观察菌种的生长特点。
⑻塞棉塞 取出接种环，灼烧试管口，并在火焰旁将棉塞塞上。塞棉塞时，不要用试管迎棉塞，以免试管在移动时带入不洁空气，如图f、g所示。
⑼环灭菌 将接接种环，再将棉花塞
（二）穿刺接种
（1）取两支新鲜柱状培养基，做好标日期，接种人等）。
（2）接种的方法量待接菌种，然后从入其底部（但不要穿线抽出接种针，注意
（3）接种后30℃察，比较两种菌的生
种环烧红灭菌。放下旋紧，如图所示。
斜面接种时的无菌操作
半固体牛肉膏蛋白胨记（写上菌名）、接种是，用接种针沾取少柱状培养基的中心穿透），然后沿原刺入路接种针不要移动。 恒温培养， 24h后观长结果。
穿刺接种示意
图
1、用斜面菌种接种液体培养基，分为两种情况：
（1）如接种量小，可用接种环（铲、针等）取不量菌体移入培养基容器中，将环在液体
（三）液体接种
表面处的器壁上轻轻摩擦，使菌苔碾散；抽出接种环再摇动液体培养基使菌体均匀分布在液体中。
（2）如接种量大，可先在斜面菌种管中倒入一定量的无菌水，用接种环将菌苔刮下，再将菌悬液倒入液体培养基中，倒前需将管口在火焰上灼烧灭菌。 （四）平板接种
以中指、无名指及小指托住培养皿下盖底部，用虎口及食指扶住上盖，再将斜面菌种管放于培养皿上之上，以拇指压住。然后以移菌环挑菌苔的菌体移入平板的中央，也可在平板上划线3-5条。
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. 五、接种后的培养
将接种后的试管、平板放适宜的条件下培养，分别于48h、72h后进行观察。 六、报告
1、观察记述所有接种培养的微生物的形态特征、生长情况等，结果填入表内：
观察项目 形 状 突 起 色 素 大 小 透明程度 气味 干湿度 菌名(细菌) 菌名(放线菌) 菌名(霉母) 菌名(酵母菌) 2、思考题： 1）接种前后为什么要灼烧接种环？
2）为什么要待接种环冷却后才能与菌种接触？是否可以将接种环放在台子上冷却？如何如何知道接种环是否已经冷却？
3）微生物接种为什么要在无菌条件下进行？ 4）接种应注意哪些环节才能避免杂菌污染？
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实验3-微生物接种技术
