6）12000rpm，15min；小心转移上清到新的离心管中，记录体积V。 7）加入2V冰乙醇，颠倒混匀；-20℃,15min。 8）12000rpm，15min，弃上清。
9）加入5mL70%乙醇，12000rpm，3min，吸弃上清液。 10）重复乙醇洗涤一次，37℃风干5-10min。
11）分次加入1mLTE溶液并转移到Ep管中，得到质粒DNA粗提物。 12）加入50ulRNase（10mg/ml），终浓度为50ug/ml，37℃孵育1-2h。 2.1.3质粒DNA的纯化
1）1ml粗提物均分于两个Ep管中，加入等体积Tris饱和酚，混匀，12000rpm离心5min。 2）转移上清V1至新管，加入V1的酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，12000rpm离心5min。 3） 转移上清V2至新管，加入V2的氯仿/异戊醇溶液，混匀，12000rpm离心5min。 4）转移上清V3至新管，加入1/10V3的3MNaAc溶液（pH=5.2），再加入2V4（V4=V3+1/10V3）的冰乙醇，混匀，-20℃保存30min。 5）12000rpm离心14min，弃上清。
6）加入500ul70%乙醇洗涤，12000rpm离心2min，弃上清。 7）重复洗涤一次，吸弃上清液，37℃风干5min。
8）每管加入25ulTE溶解沉淀，合并，得到50ul纯化质粒DNA。 2.2重组质粒的构建
2.2.1 EGFP和质粒DNA的酶切
加样顺序为：ddH2O-Buffer（缓冲液）-DNA-限制性内切酶 HindⅢ；在不同的1.5ml无菌离心管中，按照表1中Ⅰ、Ⅱ组样量顺序加入各组分（将少量的样品加在管壁上，确保加样准确）。样品混匀后，4000rpm离心1min，将液体集中于管底。酶切后，可以用电泳检测一下酶切的效果。
表1.限制性内切酶反应体系加样顺序
加样序号 反应体系成分 Ⅰ pUC19（各组） 体积（μl） 1 2 ddH2O 10X M buffer 13.0 2.0 Ⅱ EGFP（商品） 体积（μl） 70.0 10.0 3 4 共计 备注 DNA 4.0 1.0 20.0 各组1份 15.0 5.0 100.0（50+50） 全班1份 HindⅢ（15U/μl） 2.2.2载体与外源片段的连接
取无菌1.5mlEP管，加样顺序为：ddH2O-Buffer-pUC19/HindⅢ- EGFP /HindⅢ-T4DNA Ligase（见表二）
表2.T4连接酶反应体系加样顺序
加样序号 1 2 3 4 5 共计 2.3 重组DNA质粒的转化、鉴定与筛选
2.3.1 感受态细胞的制备（注意冰浴、４℃离心）
1．倒LB平板，划线活化E.coliDH5α，培养一段时间。挑取单菌落接种到5mlLB液体中，37℃震荡培养过夜。将过夜培养物按1%转接至新鲜20mlLB液体，37℃，220rmp震荡2-2.5h。 2．取2个干净的Ep管（编号SG-1-1、SG-1-2），各加入上述菌液1.5ml,4000rmp离心5min，弃上清，再各加入1.5ml菌液，4000rmp离心5min，弃上清。
3. 利用残留液体涡旋细胞，然后加入800μl预冷的0.1M CaCl2，冰浴悬浮细胞，随后4000rmp离心5min，弃上清。
4. 加入100μl冷0.1M CaCl2，轻轻悬浮细胞，冰浴20min，之后将SG-1-2分装50μl至SG-1-3管中。 2.3.2 质粒转化
按表3的序号顺序加样、操作。
表3.质粒转化
步骤：11 2 3 4 5 6 7 成分 ddH2O 10X T4 Ligase Buffer pUC19/HindⅢ EGFP /HindⅢ T4DNA Ligase 体积（μl） 3.2 1.0 1.5 3.5 0．8 10.0 →7 实验设组 感受态细胞（μl/管） 实验组 100 连接物5.0 10min 90s 5min LB：0.9ml/管，0.5-1h 转化对照 50 pUC19（自提） 1.0 细胞对照 50 麦+Ap 麦 备注 50μl×1 50μl×1 麦+Ap 麦+Ap 50μl×2 100μl×2 150μl×2 200μl×2 50μl×1 DNA（μl） 冰浴 热击 冰浴 复苏 培养基 涂布平板 预留一个空白麦+Ap平板； 共计：11（麦+Ap）和1（麦），倒置于37℃恒温箱中培养16-20h（本实验两天后来观察结果）。 2.3.3 重组子的筛选与培养
1. 观察几天前的涂布培养结果并记录，着重包括：菌落生长情况、生长的菌落的颜色、菌落数量的多少，并测量菌落的pH值。
2. 从实验组的2个50ul的平板中挑出4个白色单菌落，在事先预留的空白麦+Ap平板上分区划线培养。将接好菌的平板放在恒温培养箱中。 2.4 PCR反应 2.4.1试剂盒法提质粒
1. 观察上次划线的平板中的菌落是否为白色。用烧好的镊子夹着无菌牙签划取带有重组质粒的E.coliDH5a（白色的菌落），将带有质粒的E.coli接种于5ml LB/抗生素培养液中，37℃摇床培养12~16个小时。
2. 取1.0~5.0ml的菌液，室温下10000xg离心1min收集细菌。
3. 倒弃培养基，加入250ul SolutionⅠ/RNase A混合液，漩涡震荡使细胞完全悬浮。 4. 往重悬混合液中加入250ul SolutionⅡ，轻轻颠倒混匀4~6次，此操作避免剧烈混匀裂解液且裂解反应不要超过5min。
5. 加入350ul SolutionⅢ，温和颠倒数次至形成白色絮状沉淀。 6. 室温下，≧10000xg离心10min。
7. 转移上清液至套有2ml收集管的HiBind DNA结合柱中，室温下，10000xg离心1min，倒去收集管中的滤液。
8. 把柱子重新装回收集管，加入500ul HB Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。 9. 把柱子重新装回收集管，加入700ul DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃去滤液。 注意：浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示用无水乙醇稀释。 10. 把柱子重新装回收集管，10000xg离心空柱2min以甩干柱子基质。 注意:不要忽略次步——这对去除柱子中残留的乙醇至关重要。
11. 把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30~50ul Elution Buffer到柱子基质中，静置1~2分钟，10000xg离心1min洗脱出DNA。 2.4.2 PCR反应
在进行PCR反应之前，可以用凝胶电泳检测重组质粒，看一下重组质粒的大小，再用PCR扩增目的基因。
以EGFP 片段为模板, 设计上游引物: 5’-ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’,下游引物: 5’- GGCTGATTATGATCTAGAGTC-3’。可以先将模板适当稀释，实验要设置对照试验，可根据需求自主设计加入各组分后，分别取模板、上游和下游引物、Taq酶（5u/ul）、dd水、10× Buffer、dNTP作为 PCR反应体系（可参照表4加），轻弹混匀加入的液体，快速离心集液于管底。将制备好的PCR体系放入PCR机器中，PCR的反应程序如表5。
表4. PCR体系的建立
编号 1 2 3 4 5 6 7 总体积 组分 dd水 10×Buffer dNTP（2.5mM each） M13F（10uM） M13R（10uM） 摸板（1-10ng/ul） Taq酶（5u/ul） 加量（ul） 13.2 2.0 1.6 1 1 1.0 0.2 20.0
表5. PCR反应程序
项目 预变性 变性 复性 延伸 终延伸 保存 温度 94℃ 94℃ 58℃ 72℃ 72℃ 4℃ 时间 3min 30s 30s 60s 10min 2hr 整个 PCR 反应体系共进行 35 个循环。扩增产物用1.0%的琼脂糖凝胶电泳验证。 2.5重组表达载体的构建
2.5.1 EGFP 基因和 pET28 a 表达载体的限制性酶切处理
取上述经PCR扩增后的目的片段作为PCR反应的模板, 设计引入EcoRⅠ酶切位点的上游引物( 5’GGAG / AATTCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG3’)和 引 入Hind Ⅲ酶切位点的下游引物( 5’CCGA / AGCTTGGCTGATTATGATCTAGAGTC3’)。PCR 反应体系及反应条件同2.4.2。扩增产物用1% 琼脂糖凝胶电泳检验。PCR后的EGFP片段进行双酶切, 反应体系如下: 30L添加了酶切位点的 EGFP片段、5ul 10×buffer、1ul EcoRⅠ(20 U/L)、1ul Hind Ⅲ( 20 U/L) ,用无菌水将反应液调至 50 L 后,于 37℃下保温1 h, 然后在 65℃条件下处理20min 进行热失活。另一方面, 将pET28a 质粒载体按上述方法进行双酶切。可以用琼脂糖凝胶电泳对上述两个酶切产物进行检测。
2.5.2 pET28a-EGFP重组表达载体的构建
将上述含酶切位点的EGFP片段与线性pET28a质粒按2：1比例、在45下℃保温5 min 后, 置于冰浴中冷却,冷却后分别加入1ul T4DNA 连接酶、2ul10×T4DNA连接酶缓冲液, 37℃培养过夜。
2.6 EGFP 基因的原核表达及检测 2.6.1制备E. coli BL21感受态细胞
1．倒LB平板，划线活化E. coli BL21，培养一段时间。挑取单菌落接种到5mlLB液体中，37℃震荡培养过夜。将过夜培养物按1%转接至新鲜20mlLB液体，37℃，220rmp震荡2-2.5h。 2．取2个干净的Ep管（编号SG-1-1、SG-1-2），各加入上述菌液1.5ml,4000rmp离心5min，
荧光蛋白基因在大肠杆菌中的表达与检测
