100μl水或100μl 6倍稀释的ELISA检测为阴性的猪尿样本，插入试纸条，使样品垫一侧浸入样本溶液中。
样本测试方法：将待测猪尿样本用水作6倍稀释，混匀后取100μl加入酶标板小孔，插入试纸条。通过样本试纸条和对照试纸条检测线的显色情况比较来判断待测样本的阴阳性。
阴阳性判断标准：如样本试纸条的检测线和对照试纸条的检测线颜色深浅基本一致或略浅，结果判断为阴性；如果样本试纸条检测线没有出现或检测线颜色明显浅于对照试纸条检测线，结果判断为阳性。
组装完成的成品试纸条见图 。由于手工在NC膜上划线时无法保证检测线和质控线两条线平行，所以采用了只划检测线一条线，同时设阴性对照试纸条的方式。因此在检测过程中，每次检测都必须设阴性对照试纸条，根据待测样本试纸条的检测线的显色情况同对照试纸条比对来确定待测样本的阴阳性。试纸条阴阳性的判定结果见图 5 。
图5 试纸条检测结果的判定
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7.3 试纸条检测限的确定
本实验中试纸条检测限的确定是采用测定SM2标准品和添加了SM2的阴性的猪尿样本。由于猪尿成分比较复杂，其中部分成分对金标抗体有破坏作用，阴性猪尿样尿液直接用蒸馏水稀释，检测线位置没有红色条带出现，估计是猪尿样本中一些成分使金标抗体中的蛋白失去活性，无法与包被抗原结合。经过多次摸索，猪尿样本做6倍稀释后用试纸条进行检测比较合适。可以减少对金标抗体的破坏作用则试纸条的灵敏度还可提高。 7.3.1 测SM2标准品
将SM2工作液作系列稀释：1000ng/ml，500 ng/ml，100 ng/ml，30ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，1 ng/ml，同时设阴性对照，分别用试纸条进行测试，3个批次，两个重复试验。
将SM2工作液作系列稀释：10ng/ml，9 ng/ml，8 ng/ml，7 ng/ml，6 ng/ml，5 ng/ml，4 ng/ml，3 ng/ml，2 ng/ml，1 ng/ml，同时设阴性对照，分别用试纸条进行测试。3个批次，两个重复试验。
不同批次，不同重复试验的结果基本一致，结果见表16和表17 。由表可知，该试纸条检测含量在5ng/ml以上的SM2标准品时，结果都为阳性，检测4ng/ml的SM2标准品时，无法明确判断检测结果阴阳性，只能观测到样本试纸条检测线比对照试纸条检测线颜色浅，但差异不十分明显。多次重复后，将试纸条检测SM2标准品的检测线定为5ng/ml。
表17 试纸条检测限的确定：测SM2标准品（1000～1 ng/ml）
SM2标准品（ng/ml） 阴性样本
结果判定
－
1000 ＋
表18 试纸条检测限的确定：测SM2标准品（10～1 ng/ml）
SM2标准品(ng/ml) 阴性样本 10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
500 ＋
100 ＋
30 ＋
10 ＋
5 ＋
1 －
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结果判定
7.3.2 猪尿样本添加试验
－ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋/－ － － －
在ELISA检测为阴性的猪尿样本中添加SM2标准品，添加浓度为5000 ng/ml，1000 ng/ml，500 ng/ml，100 ng/ml，30 ng/ml，10 ng/ml，另设阴性对照样本。所有样本用水作6倍稀释后，分别用试纸条进行检测。3个批次，两个重复试验。
在ELISA检测为阴性的猪尿样本中添加SM2标准品，添加浓度为100 ng/ml，90 ng/ml，80 ng/ml，70 ng/ml，60 ng/ml，50 ng/ml，40 ng/ml，30 ng/ml，20 ng/ml，10 ng/ml，另设阴性对照样本。所有样本用水作6倍稀释后，分别用试纸条进行检测。3个批次，两个重复试验。
结果见表18和表19。由表可知，当6倍稀释后的猪尿样本中的SM2含量为5 ng/ml以上时，试纸条的检测结果为阳性，据此推断猪尿样本中试纸条的实际检测限为30 ng/ml。
表19 试纸条检测限的确定：猪尿样本添加试验（1000～1 ng/ml） 6倍稀释后 猪尿样本 (ng/ml)
检测结果
表20 试纸条检测限的确定：猪尿样本添加试验（10～1 ng/ml） 6倍稀释后 猪尿样本 (ng/ml)
检测结果
7.4 交叉反应试验
在空白猪尿中分别添加2000ng/ml，200ng/ml，30 ng/ml的下列磺胺类药物：磺胺二甲嘧啶（SM2）、磺胺甲基嘧啶（SM1）、磺胺甲噁唑（SMZ）、磺胺间甲氧嘧啶
－
＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋ ＋/－
＋
－ －
阴性样本 10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
－
＋
＋
＋
＋
＋
－
阴性样本
500
100
30
10
5
1
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（SMM）、磺胺噻唑（ST）、磺胺甲氧哒嗪（SMP）、磺胺嘧啶（SD）、氨苯磺胺（SN）、磺胺对甲氧嘧啶（SMD）、磺胺间二甲氧嘧啶（SDM），同时设阴性对照，将所有的样本用水作6倍稀释后，用试纸条进行检测。每个浓度，每份样本作2次重复。
结果见表20。由表可知，添加浓度为2000ng/ml时，6倍稀释后试纸条对SM2、SM1、SMM、ST、SMP、SD、SDM七种磺胺类药物的检测结果都为阳性；添加浓度为200ng/ml和30ng/ml时， 6倍稀释后试纸条对SM2、SM1、SDM三种磺胺类药物检测结果为阳性，这表明本实验研制的磺胺二甲嘧啶试纸条对SM1、SDM两种磺胺类药物的交叉反应率为100％。
表21 试纸条交叉反应试验
阴性
SM2 SM1 SMZ SMM ST SMP SD SN SMD SDM
200 * － ＋ ＋ － ＋ ＋ ＋ ＋ － － ＋
20
*
－ ＋ ＋ － － － － － － － ＋
5 * － ＋ ＋ － － － － － － － ＋
* 该处的数据为6倍稀释后猪尿样本中磺胺类药物的含量，单位为ng/ml。
实验结果表明试纸条对SM1、SDM两种磺胺类药物的交叉反应率为100％。因此在实际检测猪尿样本时，如果检测结果为阳性，只能推测猪尿中含有SM2、SM1、SDM三种药物中一种或几种，或同时含有其代谢产物，并且含量大于50ng/ml。 7.5 重复性试验
实验过程中，由于金标抗体超速离心纯化时重现性较差，每批试纸条组装时都需组装少量试纸条作预实验，重新筛选适宜的浓缩纯化后金标抗体稀释倍数，金标抗体喷涂量以及包被抗原稀释倍数，同时检测不同浓度标准品使试纸条的检测灵敏度符合要求。
制作试纸条时影响因素较多，不同批次的试纸条在检测线显色深浅等方面会有一定的差异。试纸条的组装生产要求在洁净的环境条件下，室温恒定，湿度小于30％。
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实验室研发试纸条是在一个非标准的环境条件下，随季节气候的变化，实验室的温度、湿度都有一定的变化，这会影响到层析材料的性质和金标抗体的活性，对试剂的展开速度，检测线的显色都有影响。在试纸条的整个研发过程中，从金标抗体的喷涂，检测线上抗原的包被，玻璃纤维素膜的裁剪到试纸条的组装，大多采用手工操作，不可避免的会有一些操作误差。在以后的批量生产工作中，还需对生产流程进行细化，优化，尽可能减小批间差异，保证不同批次试纸条的稳定性，重复性。
从3个批次的试纸条中分别随机抽取6条试纸条，用于测6倍稀释的阴性猪尿样本，5ng/ml的SM2标准品，30ng/ml添加浓度的猪尿样本，每个样本作2次重复。
结果见表21。由表可知，从3个批次的试纸条中随机抽取的试纸条对6倍稀释阴性猪尿样本、5ng/ml SM2标准品、30ng/ml添加浓度猪尿样本检测结果一致，说明不同批次间试纸条重复性较好。
表22 试纸条重复性试验
批次A 批次B 批次C
7.6 保存试验
将制作好的试纸条两条一组置于铝箔袋中，加干燥剂密闭包装，分别置于4℃、 37℃、 室温（20～25℃）条件下，其中置于4℃和室温条件的试纸条每隔7天取出两组，置于37℃每天取出两组，分别检测阴性样本和30ng/ml阳性样本。观察检测线的有无，颜色深浅及玻璃纤维素膜上金标抗体的释放程度。4℃和室温条件下的保存试验持续3个月，37℃条件下保存试验持续7天。
密闭保存于4℃、室温（20～25℃）条件下的试纸条在12次24组检测试验中，检测阴性样本水时检测线清晰，背景白色，结合释放垫上金标抗体释放完全；检测30ng/ml标准品时，对照试纸条检测线清晰，测样试纸条检测线完全消失，符合实验要求。试纸条在37℃条件下的保存到第6天，检测阴性样本水时检测线颜色开始变
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6倍稀释阴性猪尿样本
－ － －
－ － －
5ng/mlSM2标准品 ＋ ＋ ＋
＋ ＋ ＋
30ng/ml添加浓度猪尿样本
＋ ＋ ＋
＋ ＋ ＋
磺胺二甲嘧啶胶体金免疫层析试纸条的技术报告
