3.3.3 逐滴加入3ml 5％ BSA，持续搅拌10min。 3.4 金标抗体的纯化（超速离心法步骤）
3.4.1 金标抗体溶液常温低速（1500rpm）离心20min，弃去由凝聚的金颗粒形成的沉淀。红色上清溶液4℃，11000rpm 离心40min。
3.4.2 溶液分为三层，透明上清，管底可流动的暗红色沉淀及管底壁上黑色致密的金颗粒层。将可流动的暗红色沉淀转移到另外一个离心管中，用含1％BSA的0.01mol/L PB混悬至原量。
3.4.3 平衡过夜，同上重复离心2次。
3.4.4最后用1％BSA的0.01mol/L PB（含 0.02% NaN3）将沉淀混悬为原体积的1/40，4℃保存。
3.5 金标抗体的质量鉴定
将羊抗鼠二抗点样于NC膜上，直接与金标SM2单抗作用，可见有明显的粉红色斑点，表明金标抗体有活性。 4 包被抗原的合成与筛选
用于胶体金免疫层析试验的抗原和抗体必须有足够的敏感行、特异性和反应结合位点，能够和膜材料结合并与待测样品发生特异性反应。本实验中共合成了3种包被抗原，在ELISA反应中都能和单抗发生特异性反应，但将3种抗原包被到NC膜上后，只有包被抗原C能与胶体金标记的单抗发生良好的显色反应。这可能涉及到不同方法合成的包被抗原和NC膜的结合能力不同，同金标抗体的特异性结合反应也有差异，最后导致显色结果的不同。
用不同方法共合成了三种包被抗原：包被抗原A，包被抗原B和包被抗原C。 4.1 包被抗原A的合成（采用重氮化法合成SM2-OVA抗原1） 4.1.1 4ml 0.5 N H2SO4溶解57mg SM2，冷却至4℃。 4.1.2持续搅拌该溶液同时加入1ml 亚硝酸钠（19mg/ml）。
4.1.3将该混合液加入OVA溶液中（100mg 溶于 1M N2CO3 , pH 10），室温搅拌4h。 4.1.4生理盐水透析过夜，-20℃冻存。 4.2 包被抗原B的合成
4.2 包被抗原B的合成（采用戊二醛法合成SM2-OVA抗原）
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4.2.1溶液Ⅰ的配制：10mg SM2溶于1ml 甲醇中，加入9.9ml PBS。 4.2.2溶液Ⅱ的配制：300 mg OVA 溶于3ml PBS中, 过 5μm 滤膜。 4.2.3将3ml 溶液Ⅰ，3ml溶液Ⅱ和3mlPBS混合。
4.2.4持续搅拌混合液的同时缓缓加入900μl 25％（m/m）的戊二醛溶液。 4.2.5约10min后，溶液由清亮变为黄色，继续搅拌5h。 4.2.6用PBS透析4d后离心浓缩至50mg/ml，分装，-20℃冻存。 4.3 包被抗原C的合成（重氮化方法2） 4.3.1 用冰块调整水浴箱使温度衡定在4℃。 4.3.2 用移液管取N，N－二甲基苯胺200μl。 4.3.3 称取42mg氨基磺酸铵溶于蒸馏水到840μl。 4.3.4 称取18mg亚硝酸钠溶于1200μl蒸馏水。 4.3.5 称取SM2 20mg溶于2.4ml蒸馏水。
4.3.6 量取600μl 1M HCl将pH值调到1.5 并缓慢加入亚硝酸钠溶液并不断搅拌。 4.3.7 放置30min后，取氨基磺酸铵溶液滴加到上述混合物直至不再有氮气泡冒出为止。
4.3.8 取少许上述反应物,用N,N-二甲基苯胺测试,若形成深黄色表明有重氮化合物产生。
4.3.9 取0.1g OVA溶于pH9.5 0.025M的碳酸盐缓冲液（pH7.5）至1ml。 4.3.10 将重氮化SM2缓慢加入上述溶液，此混合物在4℃下过夜。
4.3.11 用pH9.5 0.025M的碳酸盐缓冲液在4℃黑暗透析3 天（每12h换液）。 4.3.12 所得物用0.22μm孔径的过滤器过滤，用无菌瓶分装成10份在4℃下保存备用。 4.4 抗原的筛选
将三种包被抗原分别稀释到0.5mg/ml，再分别作1：10、1：20、1：50、1：100、1：150、1：200、1：250稀释，在NC膜上点样，37℃温箱中干燥后，直接浸泡于金标抗体溶液中，观察不同抗原点样点的显色情况。3种包被抗原的点样结果见图。
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图 3种包被抗原的点样结果
由图可知，包被抗原B的点样显色非常浅，肉眼几乎无法分辨，包被抗原A最高稀释倍数为1：50，而包被抗原C的最高稀释倍数可达到1：200，故选择包被抗原C用于试纸条的组装。 5抗原包被各种溶液的筛选 5.1抗原包被液和包被条件的选择
分别用A、B、C、D、E五种不同配方的包被液将包被抗原作1:50，1：100，1：150，1:200，1:250，1:300稀释，在NC膜上点样后37℃ 10min烘干，用封闭液封闭后，滴加2×稀释的纯化后金标抗体，反应5min后，洗涤液洗涤，观察显色情况。 5.1.1包被液和包被条件的选择
判断标准：
＋＋＋ 表示着色很深，与背景反差很大； ＋＋ 表示着色较深或着色很深但背景色也较深； ＋ 表示着色淡或着色较深但有背景色； — 表示没有着色，或与背景色没有反差。 包被液筛选结果见表3。
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表3 包被液筛选结果
包被液 1:50 1:100 1:150 1:200 1:250
A ＋＋＋ ＋＋ ＋＋ ＋ －
B ＋＋＋ ＋＋ ＋ － －
C ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋＋ ＋＋ －
D ＋＋ ＋＋ ＋ － －
E ＋＋ ＋ － － －
由表可知，包被液C在1:200稀释后，NC膜上点样着色照样很深，而其他包被液在1:200稀释后，颜色很淡或不显色，故选择包被液C作为实际用包被稀释液。
用包被液C将包被抗原作1:50，1：100，1：150，1:200，1:250稀释，在NC膜上点样后分别37℃ 10min烘干和室温（20～25℃）30min自然干燥，其他条件不变，观察显色情况。包被条件筛选结果见表4。
表4 包被条件筛选结果
包被液C 37℃ 10min 室温（20～25℃）30min
1:50 ＋＋＋ ＋＋＋
1:100 ＋＋＋ ＋＋＋
1:150 ＋＋＋ ＋＋＋
1:200 ＋＋ ＋＋
1:250 － －
由表可知，点样后，包被液在37℃ 10min烘干和室温（20～25℃）30min自然干燥的不同包被条件差异不显著。为缩短试验过程，包被条件选择37℃ 10min烘干。 5.2封闭液和封闭条件的选择
包被抗原点样干燥后, 分别用A、B、C、D四种不同配方的封闭液进行封闭，其他条件不变，观察点样点和NC膜的显色情况。封闭液筛选结果见表5。
表5 封闭液筛选结果
封闭液 显色情况
A ＋＋＋
B ＋＋
C ＋＋
D ＋＋
由表可知，封闭液A封闭后得到的斑点颜色很深，作为背景的NC膜呈白色，同斑点颜色反差非常大，说明封闭液A封闭效果很好，将NC膜上的一些结合位点进行了封闭，使金标抗体不在NC膜上结合停留，除抗原点样处为红色，NC膜其他位置
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都为白色。封闭液B、C、D封闭后得到的斑点颜色也很深，但NC膜上呈深浅不一的粉红色，降低了斑点同背景的反差。说明封闭液A的封闭效果比其他三种封闭液封闭效果好。
包被抗原点样后，用封闭液A以不同的封闭时间10min、30min、45min、60min、120min分别在室温（20～25℃）、37℃条件下进行封闭，其它条件不变，观察显色情况。
表6 封闭条件筛选结果
封闭时间（min）
37℃ 室温（20～25℃）
10 ＋＋＋ ＋＋＋
20 ＋＋＋ ＋＋＋
40 ＋＋＋ ＋＋＋
60 ＋＋＋ ＋＋＋
120 ＋＋＋ ＋＋＋
封闭条件筛选结果见表6。由表可知，看出抗原点样后，37℃和室温条件下封闭10～120min均能得到着色较深、背景较浅的斑点。为缩短试验时间，简化操作流程，选择的封闭条件为室温（20～25℃）封闭10min。 5.3 金标抗体稀释液的选择
20ml标记好的金标抗体经超速离心纯化后得到200μl浓缩金标抗体，分别用金标抗体稀释液A、B、C、D、E作4倍稀释后，滴加到经点样、封闭后的NC膜上，观察显色情况。金标抗体稀释液筛选结果见表7。
表7 金标抗体稀释液筛选结果
金标抗体稀释液 显色情况
A ＋＋
B ＋＋
C ＋＋＋
D ＋
E ＋
由表可知，其他条件相同的情况下，经稀释液C稀释后的金标抗体滴加到NC膜上得到的斑点颜色最深，最清晰。
20ml标记好的金标抗体经超速离心纯化后得到200μl浓缩金标抗体，用金标抗体稀释液C分别作2倍、3倍、4倍、5倍、6倍稀释后，滴加到经点样、封闭后的NC膜上，观察显色情况。金标抗体稀释倍数选择结果见表8。
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磺胺二甲嘧啶胶体金免疫层析试纸条的技术报告
