和问题分析
Hessen was revised in January 2021
His蛋白纯化原理方法
组氨酸（His）标签蛋白的纯化
His-Tag融合蛋口是目前最常见的表达方式，而且很成熟，它的优点是表 达方
便而且基本不影响蛋白的活性，无论是表达的蛋白是可溶性的或者包涵体 都可以用固定金属离子亲和色谱（IMAC）纯化。
IN!AC（Immobilized Metal-ion affinity chromatography）ft Porath et 年用固定IDA作为配基的填料螯合过渡金属铜、银、钻或锌离子，可以吸附纯 化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋口，1987年Smith et al.发现 带有儿个组氨酸或色氨酸小肽和螯合金属离子的IDA-sephadex G-25作用力更 强，此询在1986年他和他的合作者用Ni2+-IDA-sephadex G-25亲和纯化在氨 基端带组氨酸和色氨酸的胰岛素原。同年1987年Hochuli et dl.发现带有相 连组氨酸的多肽和Ni2+-XTA填料作用力更强于普通的肽，1988年他第一次用 这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽，无论是在天然还是变性条件下一 次亲和纯化都得到很好效果，此后表达带六个组氨酸标签的蛋口配合IMAC变得 非常普遍，相对而言，不带标签的蛋白纯化就非常困难，所以表达带六个组氨 酸标签的蛋口配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋口结构和功能的有 力手段。1986年Porath et al.还发现Fe3+-IDA-sephadex G~25可以用于磷酸 化蛋口的纯化，而后发现Ga3+-IDA也有同样的效果，这样螯合这两种金属离子 的填料就有效用于磷酸化多肽的富集和纯化，同时IMAC也可以用于纯化各种和 金属离子结合的多肽，应用非常广泛。
Ni柱中的氯化謀可以与有His （组蛋白）标签的蛋白结合，也可以与咪哇结合。 步骤是：过柱子前可以选择Ni柱重生，也就是往柱子里倒氯化線，一个柱长体枳就行 T.然后平衡柱子，拿你自己的buffer,给蛋白提供最适的环境，我一般平衡4个柱长， 然后蛋白上样，你可以让他自己挂，这样挂柱子的效果好一些，如果流速太慢，可以加个 恒流泵，但是一左不能太快，太快挂柱效果差，当然你也可以选择循环挂柱，就是恒流泵 的一头接你装蛋白的烧杯，从柱子中留下来的液体还用冋一个烧杯接回去。挂完之后，按 理想来讲，你的蛋白在Ni柱中与Ni就结合了，杂蛋白多数在烧杯里，留下来了，当然肯 左有少量杂蛋白也挂上了，这时候你要，拿咪哇和你的buffer配，一般从0 20mM 40mM。。。。100mM这样洗脱（当你不知道你的蛋白大概在什么时候出来的时候）我指的 是咪呼的终浓度。咪卩坐加入之后，会和蛋白争夺与Ni的结合位点，杂蛋白、你的目的蛋 白，会在不同的浓度被洗脱下来，洗完之后，你可以用400mM咪哇洗柱子，淸理一切蛋 白，然后平衡几次，是否选择重生你自己泄咯~然后放上20%乙醇保存柱子就可以咯~过的 蛋白用不同的管子收下，然后SDS-page检测在哪个管子里。
市面常见的商品化IMAC用于带六个组氨酸标签蛋口的配基有以下儿种：
一、组氨 （His）标签蛋白的纯化步
大肠杆菌的破碎方法：
1） 收集培养发酵液，4度7000-8000g离心10分钟，收集沉淀的菌体（如果不 是马上破碎可以放-70度冷冻，但是最好能保存成小块或者薄片，这样好用。）
2） 取1-2克菌体加10ml破碎缓冲液（的50mM磷酸缓冲液含NaCl, ml溶菌 酶，ImM PMSF, ImM MgC12, ml Benzonase,其中的菌酶，ImM PMSF, ml Benzonase现加）在冰上混合45分钟，如果pH不在7-8,需要用NaOH -边搅 拌一边滴加?如果溶菌酶10mg/ml混合时间可以缩短到10分钟.
3） 把混合菌体在冰水中用超声探头破碎20秒种，总共四次，中间间隔要保持2 分钟冷却破碎液，检测pH,如果不在7-&还是用NaOH 一边搅拌一边滴加去调. 如果菌体的为50-500克,可以高压破碎的方法，缓冲液同上，体积为1升,破碎三 次,压力为
800 bar.
4） 破碎的液4度12000g离心10分钟，如果要让溶液更澄清，可以4度 50000g离心30分钟，这时候可以把上清和沉淀分别留样，跑电泳，如果只沉 淀中有口标蛋
白，那就用变性条件下去提取。
1. 大肠杆菌的破碎离心的上清加2M咪醴溶液使终浓度为20mM,样品的总体积 为 10mlo
2. 过柱子的样品最好过um的滤膜，避免堵柱。
3. 可溶性蛋白的纯化：
1） 平衡缓冲液：的50mM磷酸缓冲液含NaCl,含20mM咪醴。 2） 洗脱缓冲液：的50mM磷酸缓冲液含NaCl,含500mM咪醴。
3） 取1ml線琼脂糖凝胶FF或線NTA琼脂糖凝胶FF预装柱，用10ml平衡缓冲 液平衡，然后取破碎上清10ml样品以min±样，然后2ml/管分管收集。
4） 用15ml平衡缓冲液洗去未吸附的样品，流速l-2ml/min, 2ml/管收集。 5） 用5 ml洗脱缓冲液洗去未吸附的样品，流速l-2ml/min, 2ml/管收集。 6） 再用5ml平衡缓冲液平衡柱子，灌满20%乙醇，封闭，以备下次使用。
7） 此方法是通用的方法，但是未必能得到适合自己蛋白的满意效果，所以优 化的办法是洗脱可以用50mM, lOOmM, 300mM, 500mM分阶段洗脱，各洗脱5个 柱体积，这
样配合电泳检测，得到适合自己的蛋白的条件。
8） 收集的部分可以用紫外分光光度法、BCA法或用考玛斯亮蓝法测定蛋口的 浓度，再取有蛋口的部分电泳检测纯度。
二、常见问题及解决方法
1 ?不溶解或沉淀在柱子上：要留意缓冲液体的pH,此外在样品中添加一些表面 活性
剂其至乙醇等有机溶剂可以增加疏水性蛋白的溶解度，对于带半胱氨酸多 的蛋白很容易氧化聚集沉淀，所以需要加2-5mM疏基乙醇避免沉淀。
2?白不吸附：这是最常见的，通常的原因有：1是标签不暴露，被折叠在蛋口 的结构内，可以在变性的条件下去纯化，如果用服变性吸附不好，可以改用盐 酸弧，个人经验是这样通常可以使吸附不上的蛋白得到改善，顺利纯化。2可 以选择作用力更强，配基密度更高的填料，通常線琼脂糖凝胶作用力最强，如 果蛋白分子量大可以选择手臂长的填料，如線\\TA琼脂糖凝胶，填料的好坏可 以看填料的颜色，颜色越深那配基密度越高，作用力也相应要强。3样品的pH 过低或者沉淀导致不能吸附，所以样品和缓冲液的pH要尽量一致，避免沉淀， 通常再偏碱性条件下吸附更好。
3?难洗脱：如果穿透中U标蛋￡1明显减少，而洗脱乂没有，取点填料加电泳缓 冲液煮后离心跑电泳还是有H标蛋白，可以用更强的洗脱条件如500mM咪醴， 如果还不能洗脱，可以直接用500mM咪醴加到6M盐酸弧去洗脱。
4. 电泳杂带多：因为这种亲和毕竟特异性要差点，原因在蛋白中带组氨酸，色 氨酸，半胱氨酸等很常见，特别是蛋白折叠会导致儿个这样的氨基酸残基临 近，这样也会使它们和银柱的作用力增加，因此可以用不同浓度的咪醴阶段洗 脱，此外在咪醴洗脱前增加一步PH3的酷酸缓冲液洗脱，在平衡缓冲液中添 加％吐温或Triton可以避免因为疏水相互作用导致非特异吸附，这样可以电泳 的杂带明显减少，但是如果用这样的方法还是杂带多，那就地回头去看看破碎 的条件是不是太剧烈或者温度
His蛋白纯化原理方法和问题分析
