Ａｎｇ－2、ＶＥＧＦ及ＭＶＤ在胃癌中的表达及其临床意义
[摘要] 目的 探讨血管生成素-2(Ang-2)、血管内皮生长因子(VEGF )在胃癌组织中表达及其与微血管密度(MVD)和临床病理特征的关系。方法应用免疫组化两步法检测51例胃癌组织中Ang-2、VEGF 和CD34 的表达，并以24例正常胃黏膜标本作对照。对CD34 阳性血管进行MVD计数，并结合临床资料进行统计学分析。结果 胃癌组织中的Ang-2及VEGF阳性表达率分别为60.8%、53%，MVD为31.9±11.2；正常胃黏膜组织Ang-2及VEGF阳性表达率分别为12.5%、4.17%，MVD为13.1±4.3，胃癌组织中Ang-2、VEGF表达率及MVD均明显高于正常胃黏膜组织(均P＜0.01)。Ang-2表达与胃癌的大小、有无淋巴结转移、浸润深度、TNM分期有关（均P＜0.01），而与患者年龄、性别、胃癌的分化程度无关。在胃癌组织中Ang-2的表达与VEGF、MVD呈正相关（分别为r=0.846，P＜0.01；r=0.71，P＜0.01）。VEGF表达与胃癌的浸润深度、分化程度、胃癌的大小、有无淋巴结转移、TNM分期有关（P＜0.05或P＜0.01），胃癌组织中VEGF的表达与MVD呈正相关（r=0.858，P＜0.01）。MVD与胃癌的浸润深度、有无淋巴结转移、TNM分期有关（均P＜0.01）。结论 在胃癌组织中，Ang-2、VEGF的过度表达可能在肿瘤的血管生成和进展过程中起着重要作用。
[关键词] 胃癌；血管生成素-2；血管内皮生长因子；血管生成
Expression and significance of Ang-2，VEGF and MVD in gastric carcinoma
CHENG Xu-hui，OU Xi-long,YAN Fang2,GUAN Yun-yan2,YANG Liu2，SONG Yong-qian3
(1.Department of Internal Medicine,Xuzhou Guandao Hospital,Xuzhou 221008,China;2.Department of Gestroenterology，Zhongda Hospital,Southeast University，Nanjing 210009，China;
3.Department of Pathology,Xuzhou Central Hospital,Xuzhou 221000,China)
Abstract:Objective To investigate the expression of Angiopoietin-2(Ang-2)，vascular endothelial growth factor(VEGF)in gastric carcinoma and to explore their relationship with microvessel density(MVD)and clinicopathological features.Methods The expressions of Ang-2、VEGF were studied by immunohistochemistry in 51 gastric carcinoma specimens and 24 normal tissues as control.The microvessel density（MVD）was assayed by CD34 positive blood vessels counting.Results The positive rates of Ang-2,VEGF were 60.8%,53% respectively,and MVD was 31.9±11.2 in gastric carcinoma.However,in normal gastric tissues,they were 12.5%,4.17% and
13.1±4.3 respectively.Expressions of Ang-2,VEGF proteins were significantly higher in gastric carcinoma than those in normal tissue(all P＜0.01).The expression of Ang-2 was related to tumor size,penetrating depth,lymph node metastasis and TNM stage（all P＜0.01）.In gastric carcinoma,Ang-2 expression had a positive correlation with VEGF and MVD（r=0.846，P＜0.01 and r=0.71，P＜0.01 respectively）.The expression of VEGF was correlated with penetrating depth,differentiation,tumor size,lymph node metastasis and TNM stage（P＜0.05 or P＜0.01）.There was a positive correlation between VEGF expression and MVD in gastric carcinoma（r=0.858,P＜0.01）.MVD was related to penetrating depth,lymph node metastasis and TNM stage（P＜0.01）.Conclusion Over-expressions of Ang-2，VEGF proteins may play an important role in angiogenesis and progression of gastric carcinoma.
Key words：gastric carcinoma；Angiopoietin-2;vascular endothelial grouth factor；angiogenesis
(Modern Medical Journal,2008,36:86-91)
肿瘤性血管生成是肿瘤发生发展的先决条件，Garcea等[1]发现新生血管的形成导致原发肿瘤细胞呈快速指数性增长。有多种血管生成因子参与肿瘤性血管生成的调控,起促进作用的主要有血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和血管生成素（Angiopoietin,Ang）。Ang-2主要由血管内皮细胞分泌产生，在病理状态下Ang-2 主要表达于肿瘤、炎症、创伤等部位，参与病理性血管的形成、重建，且以新生血管网的前沿最为丰富。VEGF是一类作用最强、特异性最高的可溶性血管生成促进因子，与肿瘤的生长、侵袭和转移等特性密切相关[2]。然而，Ang-2和VEGF在胃癌中的关系和相互作用的机制尚不完全明确。本研究运用免疫组化方法研究了Ang-2和VEGF 在胃癌中的表达及其相关性，并探讨其生物学意义。
1 资料与方法
1.1 一般资料
51例胃癌标本，其中男28例，女23例，年龄35~76岁，平均62.4岁。高、中分化胃癌29例，低分化胃癌22 例。TNM 分期Ⅰ-Ⅱ期20例，Ⅲ-Ⅳ期31例。均为2005年1月至2006年6月徐州市中心医院临床和病理资料完整的手术切除原发胃癌标本。24例正常胃黏膜标本作为对照。
1.2 试剂
兔抗人Ang-2及VEGF多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司，鼠抗人CD34单克隆抗体、Supervision试剂购自上海长岛生物技术有限公司。
1.3 方法
采用免疫组化两步法进行。手术标本经4%甲醛固定，石蜡包埋切片，石蜡切片4μm贴在涂有切片黏合剂的载玻片上，58℃烤4h，切片用二甲苯脱蜡，梯度酒精水化。浸入3%的双氧水中30min，以阻断内源性过氧化物酶的活性。 然后将玻片置入0.01mol·L-1、pH6.0的柠檬酸缓冲液中微波抗原热修复（95℃10min）。自然冷却至室温。山羊血清培育30min以封闭非特异性抗原，分别滴加兔抗人Ang-2及VEGF多克隆抗体（工作浓度1∶50），鼠抗人CD34单克隆抗体（工作浓度1∶100），置4℃冰箱过夜，37℃复温30min。加入Supervision试剂，37℃10~15min。用DAB显色，自来水洗涤，复染（苏木素衬染30s，水洗，盐酸乙醇蓝化2s，水洗，微波蓝化）。以上每步均用PBS浸洗3次，每次5min。中性树胶封固，光镜下观察。
1.4 阳性结果判断
以PBS替代第一抗体作阴性对照，已知阳性片作阳性对照。免疫组化染色显示细胞膜或细胞浆染成棕褐色或棕黄色为Ang-2和VEGF阳性表达，随机选择5个高倍视野（×400），连续记数500个肿瘤细胞中阳性细胞数。①以着色细胞占视野细胞总数的多少分0～3级。0级:0;1级:50%。②按着色细胞染色强弱分0~3级。0级:阴性;1级:弱,淡黄色;2级:中等,棕黄色;3级:强,棕褐色。按①②值相加判断结果,以0～2为阴性“-”;3～4为弱阳性“+”；5～6为强阳性“++”。将“+”和“++”都计为阳性，以简化数据处理。
1.5 MVD计数
在肿瘤区凡是染成棕黄色的单个内皮细胞或内皮细胞簇均作为一个血管计数，每例首先在低倍镜下（×100）选择微血管密度最高的肿瘤区域，然后在高倍光镜下（×400），随机计数5个视野内微血管数，再求其平均值为微血管密度。计数时管腔直径≤50μm者判为微血管，直径>50μm或管壁含有肌层者不作为微血管计数，另外单个染色细胞或成群无管腔的染色细胞也作为独立微血管计数。
1.6 统计学处理
MVD以x-±s表示。计数资料的比较采用χ2检验，计量资料的比较采用t检验；等级相关采用Spearman等级相关分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。
2结 果
2.1Ang-2、VEGF及MVD在正常胃黏膜和胃癌组织中的表达
Ang-2、VEGF在胃癌和正常胃黏膜组织均有不同程度的阳性表达，在血管内皮细胞及肿瘤细胞中均可见棕黄色颗粒状物质，主要位于胞浆；阳性细胞在癌组织中广泛分布，其中血管内皮、血管周围的表达较为集中，免疫组化结果见图1、2。Ang-2在胃癌中的阳性表达率（60.8%）明显高于在正常胃黏膜组织（12.5%），差别有统计学意义(χ2=15.4，P＜0.01）。VEGF在正常胃黏膜组织中表达极低，在胃癌中的阳性表达率(53%)明显高于正常胃黏膜组织（4.17%）,差别有统计学意义(χ2=16.6，P＜0.01）,见表1。CD34染色定位于血管内皮上，呈棕黄色,最密集的染色区域主要位于癌灶边缘,有些胃癌的新生血管已成管腔样结构,有些只见内皮细胞呈点状或线状分布，免疫组化结果见图3。胃癌中的MVD计数（31.9±11.2）明显高于正常胃黏膜组织（13.1±4.3），差别有统计学意义（t=3.06，P＜0.01），见表1。
2.2Ang-2、VEGF表达与胃癌临床病理特征的关系
Ang-2表达与胃癌患者的年龄、性别、分化程度无关（P＞0.05），而与肿瘤大小、有无淋巴结转移、浸润深度、TNM分期有关（均P＜0.01)（表2）。大于5cm的胃癌组织Ang-2表达率为78.8%，高于小于5cm的表达率（27.8%）（χ２=12.71，P＜0.01）;侵及浆膜的胃癌组织中Ang-2表达率为76.5%，明显高于未侵及浆膜的表达率（29.4%）（χ２=10.53，P＜0.01）;伴有淋巴结转移的胃癌组织中Ang-2表达率为77.1%，明显高于无淋巴结转移的表达率（25%）（χ２=12.5，P＜0.01）。TNM分期中Ⅲ-Ⅳ期的胃癌组织中Ang-2表达率为77.4%，明显著高于Ⅰ-Ⅱ期的表达率（35%）（χ２=9.17，P＜0.01）。VEGF与胃癌的大小（χ2=10.54，P＜0.01）、有无淋巴结转移（χ2=27.3，P＜0.01）、浸润深度（χ2=5.67，P＜0.05）、TNM分期有关（χ2=10.31，P＜0.01）。MVD与患者性别、年龄、肿瘤大小、分化程度无关，而与淋巴结转移、浸润至浆膜、TNM分期有关(均P＜0.01)（表2）。有淋巴结转移的胃癌组织中MVD为35.4±10.2，无淋巴结转移的MVD为24.6±11.9，二者相比差异有统计学意义（t=3.33,P＜0.01）；侵及浆膜的胃癌组织MVD为38.3±12.8，明显高于未侵及浆膜的MVD（27.7±10.7）（t=2.93,P＜0.01）；Ⅲ-Ⅳ期的胃癌组织中MVD为36.2±11.2,明显
高于Ⅰ-Ⅱ期的MVD(27.2±8.5)（t=3.07,P＜0.01）。
2.3 Ang-2表达与MVD在胃癌中的相关性
在20例Ang-2阴性表达者中MVD为25.1±10.3，而在31例Ang-2阳性表达者中MVD为36.7±11.4，Ang-2表达阳性与阴性者MVD差异有统计学意义（t=3.68,P＜0.01）。经相关分析显示，在胃癌组织中Ang-2表达与MVD呈正相关（r=0.71，P＜0.01）
2.4 胃癌组织中VEGF表达与MVD的相关性
胃癌组织中VEGF阳性表达者的MVD为35.7±10.3，VEGF阴性表达者的MVD为24.6±11.7，VEGF表达阳性与阴性者MVD差异有统计学意义（t=3.6,P＜0.01）。经相关分析显示，胃癌组织中VEGF与MVD呈正相关（r=0.858，P＜0.01）。
2.5 胃癌组织中Ang-2表达与VEGF的相关性
51例胃癌组织有20例Ang-2表达阴性，24例VEGF表达阴性。在20例Ang-2阴性表达者中VEGF同时为阴性的有14例，在31例Ang-2阳性表达者中VEGF同时为阳性的有21例（χ２=6.95，P＜0.01）。经相关分析显示，在胃癌组织Ang-2表达与VEGF表达呈正相关（r=0.846，P＜0.01）。
3讨 论
肿瘤性血管是高度不成熟的血管，它的生成依赖肿瘤组织产生的促血管生成因子的作用，后者需要克服保持血管稳定的因素，这些过程包括离断血管外周细胞和破坏血管形成的微环境及刺激内皮细胞增殖和迁徙的过程。Ang家族是一类新型的血管生成调节剂,Ang-2与Tie-2受体结合不能引起后者磷酸化，从而阻断血管形成信号，离断血管内皮细胞与血管周细胞的结合[3]，而且Ang-2可以有效地刺激内皮始祖细胞（endothelial progenitor cells，EPC)增殖，从而促使新生血管生成[4]。目前已在胃癌[5-6]、结直肠癌[7]、肝癌[8]、神经胶质瘤[9]等多种肿瘤细胞中检测到Ang-2 的存在。通过选择性阻断Ang-2与Tie2的结合，可以抑制荷瘤小鼠的新生血管形成和肿瘤生长[10]。Etoh等[5]应用northern杂交研究表明:Ang-2表达量与胃癌肿瘤血管的数量和肿瘤TNM分期呈正相关,Ang-2表达水平高的,肿瘤恶性程度就高,同时患者存活时间也短。Nakayama等[11]研究发现Ang-2在胃癌组织中阳性表达率为84.3%，结直肠癌组织为92.7%，说明Ang-2在肿瘤血管生成过程中可能发挥着重要作用。Ang-2表达是肿瘤血管新生起始及加强的因素，与肿瘤血管形成数目、临床分期、预后关系密切[7]。
Ang-2、VEGF及MVD在胃癌中的表达及其临床意义
