转录共激活因子TAZ对人牙髓干细胞体外增殖的影响

转录共激活因子TAZ 对人牙髓干细胞体外增殖的影响

张 文1，罗士维1，谷爱玲2，何 巍1(1郑州大学第一附属医院口腔医学中心，河南省郑州市 450052；2濮阳市人民医院，河南省濮阳市 457099) 【摘 要】摘要

【期刊名称】中国组织工程研究 【年(卷),期】2018(022)009 【总页数】6

【关键词】人牙髓干细胞；转录共激活因子TAZ；干细胞；细胞增殖；TGF-β通路 ·研究原著·

背景：如何提高人牙髓干细胞体外增殖能力对于再生医学具有重要的意义。 目的：探讨转录共激活因子TAZ对人牙髓干细胞增殖的影响和潜在的作用机制。 方法：分离培养人牙髓干细胞，利用细胞免疫荧光法检测TAZ在人牙髓干细胞中的表达；用siRNA敲减TAZ表达后，通过MTT法和BrdU细胞增殖试剂盒检测人牙髓干细胞增殖情况；通过实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹法检测TAZ下游靶基因CTGF和Cry61的表达；蛋白免疫印迹法进一步检测TAZ对TGF-β通路蛋白Smad3和Smad4表达的影响。

结果与结论：①人牙髓干细胞表达TAZ蛋白；②细胞转染siTAZ 48 h后，TAZ mRNA和蛋白表达水平均显著降低；转染siTAZ 24 h和48 h后，人牙髓干细胞增殖速度均显著下降；③细胞转染siTAZ后，TAZ下游靶基因CTGF和Cyr61 mRNA和蛋白表达均受到抑制；④细胞转染siTAZ后，TGF-β通路蛋白Smad3和Smad4的表达水平降低；⑤以上结果表明，TGF-β依赖性信号通路

可能参与了TAZ调节CTGF和Cyr61表达，从而调控人牙髓干细胞的增殖。

0 引言 Introduction

人牙髓干细胞(human dental pulp stem cells，hDPSCs)是来源于人体牙髓的一类具有自我增殖、分化能力的干细胞，由于具有高度的分化能力和自我增殖能力等生物学特性而受到干细胞研究者的极大关注[1-2]。另外，由于具有非侵入性取材和获取途径相对简单等特点，其被认为在再生医学(如人工组织)领域具有巨大的潜在应用价值[3]。然而，人牙髓干细胞的增殖能力和生命周期受多种内在机制和微环境因素的影响，进而影响其在再生医学的应用[4-7]。因此，研究人牙髓干细胞体外增殖的分子机制对其应用于再生医学具有重要意义。 转录共激活因子TAZ属于14-3-3胞浆蛋白家族[8]。前期研究结果提示TAZ可以调控干细胞的增殖、黏附、迁移等一系列生物过程和诱导上皮细胞向间充质细胞的转化[9-14]，同时还参与了胚胎发育过程如骨骼、肺和心脏等的发育成熟[15-17]。然而，TAZ是否也参与调节人牙髓干细胞的增殖过程目前仍不清楚。因此，实验通过沉默TAZ的表达，观察其对人牙髓干细胞体外增殖的影响，同时探索其潜在的分子机制。

1 材料和方法 Materials and methods

1.1 设计 细胞学体外观察实验。

1.2 时间及地点 于2015年1月至2017年1月在郑州大学第一附属医院口腔医学中心完成。 1.3 材料

1.3.1 新鲜的牙髓组织块 来源于郑州大学第一附属医院口腔医学中心就诊的因正畸减数拔除恒牙的患者，年龄16-30岁。患者及家属签署了知情同意书，研

究方案经郑州大学第一附属医院伦理委员会批准。

1.3.2 实验主要试剂和仪器 DMEM培养基、血清(美国，GIBCO公司)；L-谷氨酰胺(美国，Sigma公司)；Anti-TAZ、CTGF、Cy61、Smad3、Smad4、GAPDH抗体(美国，Abcam公司)；Anti-Mouse/Rabbit荧光二抗Hoechst(美国，TermoFisher公司)；二甲基亚砜(美国，MP公司)；噻唑蓝(美国，Sigma公司)；Trizol试剂盒(美国，Invitrogen公司)；RNA反转录试剂盒(美国，Thermo公司)；实时荧光定量PCR试剂盒(美国，Thermo公司)；BrdU细胞增殖检测试剂盒(美国，罗氏公司)；凝胶成像仪(美国，Bio-Rad公司)；实时荧光定量PCR仪(美国，Bio-Rad公司)；倒置相差荧光显微镜(日本，尼康公司)。 1.4 实验方法

1.4.1 人牙髓干细胞分离培养 选取因正畸减数拔除的健康恒牙，拔除后使用体积分数为75%乙醇消毒，再用含有青霉素和链霉素的PBS清洗2次。取出牙髓组织并剪碎，用2%Ⅰ型胶原酶消化约40 min，1 000 r/min离心5 min，弃上清，使用含体积分数为10%胎牛血清的DMEM培养基重悬细胞，接种于培养皿，37 ℃体积分数为5%CO2恒温培养箱中培养，待细胞长至80%汇合率时，消化传代。

1.4.2 细胞免疫荧光检测 取第3-5代人牙髓干细胞，以1×108 L-1的细胞浓度接种于含有无菌盖玻片的培养板中，培养过夜后，加入40 g/L多聚甲醛室温固定10 min，PBS洗3遍，每次5 min；0.5% Triton X-100打孔5 min，PBS洗3遍，每次5 min；1% BSA室温孵育30 min后，加入1︰200稀释的Anti-TAZ抗体4℃孵育过夜，PBS洗3遍，每次5 min；1︰100稀释的