目的： 筛选物种文库在酵母菌株INVSc1中耐盐（NaCl）的基因。
方法：将pYES2-NTB空载转化酵母菌株INVSc1作为对照组，通过酵母表型验证，筛选耐盐基因。
材料：
1．载体：pYES2-NTB 2．培养基：
1). 酵母完全培养基：
YPDA：1% Yeast extract，2% Tryptone，2% Glucose, 0.02% Adenine。 2). 酵母缺陷型筛选培养基：
参照Clontech公司的PT3024-1/Yeast Protocols Handbook，其中各种培养基分别以下列符号表示：SD-U：-Ura，SG-U：-Ura。 3. 其他贮备液：
10 × TE：0.1 M Tris-HCl（pH7.5），10 mM EDTA，高压灭菌； 10 ×LiAc：1 M LiAc (pH7.5)，高压灭菌。 4.氯化钠NaCl：
配制好SG-U固体培养基后加入，培养基中的NaCl终浓度为0、0.5、1.0、1.3、1.5、2.0M。
第一部分文库构建 之前已完成物种文库构建。
第二部分将空载质粒转化受体菌INVSc1
1.1酵母转化
将以下质粒分别转入INVSc1中：
Reaction 1
pYES2-NTB
1.2 酵母转化方法
1. 从YPDA平板挑取INVSc1单菌落接种于YPDA液体培养基4 ml，30℃，225 rpm，振荡培养18-20 h（过夜），至OD600>1.5。
2. 转接YPDA液体培养基，培养体积为50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5h，至OD600=0.6。
3. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4. 用20 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 5. 用5 ml 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
6. 用500 ul 0.1 M LiAc重悬菌体，混匀，分装至1.5 ml离心管，每个50 ul（每个转化），备用。
7. 每个1.5 ml离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
240 ul
1 M LiAc
36 ul
ssDNA mg/ml)
5 ul
(20
质粒DNA
5 ul
plasmid
涂板种类 SD-U
对照组 备注
8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏，30 min。
11. 离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
12. 每个转化用200 ul无菌水悬浮菌体，尽量温和地混匀，涂布相应的缺陷型筛选平板。
13. 30℃恒温培养4天。 1.3阳性克隆PCR验证
从转化的平板上随机挑取8个点，进行PCR验证。 第三部分将物种文库转化受体菌INVSc1
1.1 文库质粒转化
1. 从YPD平板挑取单菌种接于液体YPD培养基5 ml，30℃，225 rpm，振荡培养24 h。
2. 转接于YPDA液体50 ml，使初始OD600=0.2，30℃，225 rpm，振荡培养4-5 h，至OD600=0.6。
3.离心收菌，室温，4000 rpm，5 min。
4.用30 ml无菌水重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。 5.用20 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm，5 min，弃上清。
6.用10 ml 0.1M LiAc重悬菌体，混匀，离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清。
7.向离心管中依次加入如下试剂，用枪头吹打混匀，或剧烈振荡1 min左右，至完全混匀。
50%PEG3350
1 LiAc
1.44 ml
M
ssDNA mg/ml)
(10
文库质粒DNA
9.6 ml 300 ul 25 ug
8. 30℃水浴孵育，30 min。 9. 42℃水浴热激，25 min。 10. 30℃水浴复苏1 h。
11.离心收菌，室温，4000 rpm ，5 min，弃上清，用6ml无菌水重悬菌体，尽量温和地混匀，从中取20 ul培养物稀释后涂SD-U平板，共20块。
12. 30℃恒温培养3-7天，观察菌落生长。
13. 待菌落长出，用YPD液体培养基把板上菌落刮下，以500 ul/管分装，加入500 ul 50%甘油制备成酵母工作菌液，保存于-80℃。
14. 从中取10 ul稀释105倍，涂布于SD-U平板，用于检测文库库容，30℃恒温培养3-7天，观察菌落生长并计数。
15. 随机取24个克隆进行菌落PCR验证文库转化质量。 第四部分盐浓度筛选
1. 制备一系列分别含有0 M、0.5 M、1.0 M、1.3 M、1.5 M、2.0 MNaCl的SG-U（半乳糖取代葡萄糖）固体培养基。
2. 取工作菌液与空载对照菌株，用ddH2O稀释至OD600=0.6。
3. 分别吸取100 ul涂布于上述一系列平板中，30℃恒温培养7天后，观察菌落生长情况，确定盐筛选浓度。
4. 在上述浓度下，涂布文库工作菌液，共20个平板。 5. 待克隆长出后，随机挑取96个克隆进行菌落PCR并测序。 6. 测序结果BLAST比对后，进行回转验证。
第五部分实验结果
5.1 文库库容
图1. 文库库容
5.2 文库质量检测
图2. 文库质量鉴定
5.3 盐浓度筛选 文库菌液：
对照菌液：
结论：选择1.5 MNaCl浓度作为文库筛选条件。
图3. 盐浓度筛选
5.4 测序结果BLAST 结果见附件表格
5.5 回转验证 SG-U：
SG-U+1.5M NaCl：
图4. 回转验证
阴性对照:pYES2-NTB
阴性对照在SG-U平板上能正常生长，而在SG-U+1.5M NaCl不能生长。 筛选出来的阳性克隆在SG-U、SG-U+1.5M NaCl均能正常生长。
南京瑞源生物技术有限公司坐落于南京市栖霞区生命科技园，专注于基因组高通量研究领域，致力于生物高科技研发，目前产品的技术水平已达到省级实验水平，瑞源生物立足于生命科学，为基础研究领域科学工作者提供生物学技术服务，自2019年创立以来，全体员工致力于利用酵母系统研发新药物靶点，专注于生物学研究，长期与全国各大农林/医药院校在大型科研技术研发上紧密合作。目前已经成熟的产品线如下:酵母文库的构建、酵母双杂交筛选体系酵母单杂交筛选体系、酵母菌落快速鉴定试剂盒、酵母质粒快速抽提试剂盒、蛋白质免疫沉淀检测服务、酵母体系非生物胁迫抗逆性筛选以及 CUT&Tag服务等。
新-酵母高通量筛选耐盐基因报告 - 图文
