血管内皮生长因子与细胞支架复合物修复大鼠股骨缺损(一)
作者：徐成振,马鹏,徐晓峰,李阳,钱栋
【摘要】目的：探讨血管内皮生长因子(VEGF)与骨髓间充质干细胞（MSCs）、纳米晶胶原基骨(nHAC)复合物对大鼠股骨缺损的修复作用。方法：将20只SD大鼠制成股骨缺损模型后分2组：对照组植入MSCs/nHAC复合物，实验组植入VEGF/MSCs/nHAC复合物。术后第2，4，8周行影像学和组织学观察;术后第8周行新生骨痂环境扫描电镜（ESEM）检查。结果：术后第2，4，8周实验组与对照组放射学检查评价骨生成差异有统计学意义(P0.05)。组织学观察发现实验组较对照组能更快更有效地促进大鼠股骨缺损处的骨痂生长。结论：VEGF/MSCs/nHAC支架较MSCs/nHAC支架对骨缺损的修复有更好的效果。
【关键词】血管内皮生长因子；骨髓间充质干细胞；纳米晶胶原基骨；骨缺损；环境扫描电镜
〔Abstract〕Objective:Toevaluatetheeffectofvascularendothelialgrowthfactor（VEGF）ollagen(nHAC)boneonthetreatmentofratfemoralbonedefects.Methods
：
to2groupsrandomly:Incontrolgroup，defectwasfilledwithnHAC/MSCsscaffolds;inexperimentgroupwasfilledwithMSCs/VEGF/nHAC.Imagingandhistologicalobservationweremadeinthe2nd，4thand8thweeksafteroperation.Environmentscanningelectronmicroscope(ESEM)observationwasmadeinthe8thweekafteroperation.Results：Thereweresignificantdifferencesinboneregenerationbetweencontrolgroupandexperimentgroupinthe2nd，4thand8thweeksafteroperation(P0.05).Histomorphologyobservationshowedthatnewosteotylusofexperimentgroupwasearlierandmorethancontrolgroup.Conclusion：asstrongerthanMSCs/nHAC. 〔
Keywords〕
bonedefect;environmentscanningelectronmicroscope 骨缺损的修复仍然是当前临床骨科面临的难题之一。目前常用的手术治疗方式主要有自体骨移植、异体骨移植和人工骨移植等。骨组织工程学的出现，为这一难题提出了新思路，现阶段骨组织工程学的研究主要集中在种子细胞、支架材料和构建方式三个方面。骨髓间充质干细胞（marrowmesenchymalstemcells,MSCs）是最有应用前景的种子细胞,纳米晶胶原基骨
，nHAC)也已经作为骨缺损代用人工合成生物支架材料应用于
临床，研究表明其复合MSCs后具有体内成骨能力〔1〕。本实验选用MSCs为种子细胞与nHAC支架培养后复合血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor，VEGF)来构建VEGF/MSCs/nHAC复合体修复大鼠股骨缺损，观察VEGF在骨修复过程中的作用。 1材料和方法 1.1材料
1.1.1实验动物SPF（specificpathogenfree）级（SD）大鼠20只,5～6周龄，体质量140～160g，雌雄不限；4周龄SD大鼠4只（获得MSCs用），体质量60～100g,由江苏大学动物实验中心提供。 1.1.2主要试剂及仪器nHAC，由清华大学材料系提供；、胎牛血清、胰蛋白酶(Gbico公司)；孔径40μm细胞筛（英国AmershamBiosciences公司）；5810R低温离心机（德国
Eppendorf公司）；光学显微镜（日本Olympus），VEGF（PeproTech公司）。 1.2方法
1.2.1SD大鼠MSCs的获得、传代取健康幼年SD大鼠(80g左右)，0.3%戊巴比妥钠35mg/kg腹腔注射麻醉。断颈处死，消毒后无菌条件下取双侧股骨，除去骨表面附着的软组织，用含10%胎牛血清的浸泡清洗，切除两端骨骺，显露骨髓腔。用培养液冲洗骨髓腔，以冲出骨髓；轻轻吹打，制成单细胞悬液；1000r/min离心20min，离心后去上清，用完全培养液（含10%胎牛血清、10nmol/L地塞米松、50mg/L维生素C、甘油磷酸钠的）重悬，移入培养瓶中，用完全培养液培养。所得细胞悬液接种25ml塑料培养瓶中,置37℃、体积分数5%的CO2、饱和湿度条件下培养。第3天更换培养液。以后每3d换液1次，去除未贴壁的细胞，待细胞汇合约80%时，用2.5g/L胰蛋白酶及0.4g/L乙二胺四乙酸消化，按1∶2传代培养。
1.2.2nHAC复合MSCs及VEGF的制备超净台内使用手术刀片将nHAC（已消毒包装）切割成2mm×2mm×2mm大小，使用前置24孔板中，用含15％FBS的培养液浸润24h。吸净24孔板中的，每孔各加100μl含15％FBS的培养液，将培养的第3代大鼠MSCs使用0.25%胰蛋白酶消化后，离心制成细胞悬液，细胞计数板将细胞浓度调整到5×106/ml，吹打均匀，微量移液管吸取100μl滴到材料nHAC表面，37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱内静置培养2h后，反转材料，向材料另一面滴加100μl细胞悬液，37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱内静置培养2h后，加（含15％FBS）浸没材料，37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱内静置培养，每3d换液1次，复合培养14d。
取一半制备好的大小均一的MSCs/nHAC支架与VEGF溶液充分混匀,吸附2h后，在真空机中抽吸出支架中的气体,使VEGF充分吸入支架（每只鼠植入支架约含VEGF0.8μg）分别密封于双层聚乙烯薄膜内,γ射线2.5×105Gry,照射1h后,-70℃深低温冷冻干燥24h,置于4℃冰箱备用。另一半MSCs/nHAC支架不加VEGF按上述方法冻干备用。
1.2.3构建骨缺损模型及植入组织工程骨选取成年SD大鼠20只,每组10只，雌雄不限,称重后用0.3%戊巴比妥钠30～35mg/kg剂量腹腔注射麻醉。麻醉后,取俯卧位,术野处剪毛消毒,取下肢后外侧切口,显露股骨,用手术剪造成股骨中段0.5cm的骨缺损模型(包括骨膜)。对照组植入MSCs/nHAC支架，实验组植入VEGF/MSCs/nHAC支架。术后肌注青霉素8万单位,连注3d,不做内外固定，常规颗粒饲料饲养。术中严格无菌操作，所有骨缺损模型均由同一组人员完成，骨缺损长度、截骨位置均相同。实验过程中对动物处置符合动物伦理学要求。 1.3观察指标
1.3.1一般情况术后观察动物的进食、活动和切口愈合等一般情况。
1.3.2大体观察术后第2，4，8周每组各随机处死1只大鼠切取股骨标本，编号，剥离附着肌肉等软组织，行大体观察了解骨缺损修复情况，注意缺损区是否完全为新骨修复，新骨与断端连接情况以及塑形良好与否。
1.3.3X线检查分别于术后第2，4，8周随机选取2只大鼠摄术侧股骨正侧位X线片,以了解骨缺损的修复情况，并根据参考文献〔2〕评分标准进行放射学评分评估。
1.3.4病理组织HE切片术后第2，4，8周随机选取2只大鼠，处死后剔除股骨软组织，行HE染色观察骨痂生长情况。
1.3.5骨密度测量术后第2，4，8周随机选取3只大鼠，处死后剔除股骨软组织，CHALLENGE双能量X射线骨密度仪上测量骨缺损区的骨密度，每个标本所选定的测量区的位置、面积均相同，所测值为相对值。
1.3.6环境扫描电镜（ESEM）观察术后第8周每组随机选取1只大鼠处死后剔除软组织，新生骨痂处做ESEM观察新生骨小梁情况。 1.4统计学处理
实验数据以均数±标准差表示，采用SPSS11.5统计软件中的两独立样本间的t检验,P0.05为差异有统计学意义。
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