牛奶中酪蛋白和乳糖的分离
张意（200131040037） 赵玉堃（200131040039） （武汉大学化学与分子科学学院，湖北，武汉，430072）
牛奶是一种营养且易于消化吸收的物质。在婴儿及青少年时期，每天喝一定量的牛奶能促进身体健康成长。牛奶的主要成分是水、蛋白质、脂肪、糖和矿物质，这些都是人体发育所必不可少的物质。
牛奶中的蛋白质主要是酪蛋白，在牛奶中以其钙盐形式存在，即酪蛋白钙。利用蛋白质在等电点时溶解度最小的特性把牛奶的PH值调到酪蛋白的等电点（PH = 4.8）来沉淀分离酪蛋白。酪蛋白不溶于乙醇，故可用乙醇将其中的脂肪除去。
乳糖是哺乳动物乳腺分泌的特有的碳水化合物，在牛乳中含量为4．7％，占干物质 的38～39％。乳糖在乳中全部呈溶解状态存在。乳糖在乳中存在三种型态：?-乳糖、?-乳糖和少量醛型乳糖。另外，乳糖不溶于乙醇，所以当乙醇混入水溶液中时，乳糖会结晶出来，从而达到分离的目的。
一. 材料与方法
1. 实验仪器：
烧杯（250、100、50 ml）；HH-6数显恒温水浴锅；DYY－Ⅲ型稳压电泳仪；简易抽滤装置；精密PH试纸；抽滤瓶；布氏漏斗；锥形瓶；数字旋光仪；蒸发皿。
2. 实验药品及材料：
新鲜牛奶（伊力纯牛奶）；10％HAc溶液；碳酸钙；95％乙醇；乙醚和乙醇的混合液（1：1）；乙醚；考马斯亮蓝R试剂；硫酸铜；氢氧化钠。
3. 实验方法：
（1）酪蛋白的分离
操作： 取20ml新鲜牛奶置于250 ml烧杯中，加热至 45℃，在搅拌下慢慢加入10％乙酸溶液，使混合物溶液的 PH值为4.2，在这过程中不停的搅拌。过滤（在滤液中立即加入适量粉状碳酸钙，并搅拌几分钟，留作下面实验（2）用）。依次用适量的95％的乙醇，乙醇和乙醚的等体积混合液，乙醚洗涤沉淀1~2次，捣碎固体团块。用布氏漏斗过滤后把固体转移至表面皿上，让乙醚挥发掉，自然干燥，并对所得酪蛋白称重 。
现象： 温水浴条件下缓慢滴加HAc溶液，有白色块状沉淀产生，搅拌后变成小颗粒状。过滤速度较慢，用乙醇及其它洗液洗后最终得白色颗粒状固体1.6g。用表面皿盖住放置一周后，颜色略显淡黄，且略带粘性，可能是因为带有微量脂肪。另外所得滤液澄清，置于100ml锥形瓶中。 （2）乳糖的分离
操作：把实验（1）中已经加入碳酸钙的滤液，用蒸汽浴加热蒸发，使水挥发至液体体积约3mL，再加入18ml无水乙醇，加热并搅拌使其混合均匀，趁热将混合物用布氏漏斗过滤，除去沉淀的蛋白质和残余碳酸钙。把滤液转移至锥形瓶中盖上塞子，放置l－2天，让乳糖充分结晶，过滤，分离出乳糖晶体，待其干燥后，称重。
现象：第二天观察发现锥形瓶壁上有乳糖晶体析出。将其刮下，过滤并洗涤晶体，称重得纯白色乳糖晶体1.2g。 （3）酪蛋白的鉴定
将少量酪蛋白溶解于水中，进行下列反应：
（a） 缩二脲反应：取少量酪蛋白酪于试管，加适量水和稀NaOH溶液使酪蛋白溶解，再向溶液中加入氨水和稀硫酸铜溶液，振荡试管，溶液颜色变为紫色。
（b） 蛋白质反应：取少量酪蛋白酪于试管，加入2ml水，再加入0.5ml硝酸，振荡，加热煮沸，溶液和沉淀都变成黄色。冷却后，加入过量氨水，溶液变成棕色，再加入HAc溶液，又变成黄色。 （c）茚三酮反应：取少量酪蛋白溶于适量稀NaOH溶液中，加入少量稀茚三酮溶液，振荡后显紫色。此为α氨基酸的特征反应，可用于定性定量分析。 茚三酮 ＋ RCHNH2CO2H → RCHO + CO + 3H2O + 显紫色物质 （4）乳糖的变旋光测定
操作：精确称取1.25克乳糖，快速配成25ml 水溶液，装入旋光管，迅速测定其旋光度，每隔一分钟测一次。10分钟后，每隔2分钟测一次，至20分钟为止，记录旋光度的数据。在乳糖水溶液中加入2滴氨水，摇匀，静置202分钟后测其旋光度，计算比旋光度。 现象：由于乳糖的产量很少，只有1.2g，就先加入15ml水溶解，结果基本上不溶。于是另取一份乳糖来做。先预先将水加热至约25度，再加入乳糖，结果还是不能完全溶解。可能原因是乳糖不纯或者是水温不够，致使溶解速度过慢。经过观察，在当时的室温（8.5摄氏度）下，完全溶解基本上是不可能的。 （5）酪蛋白的电泳试验
操作：在纸的中心划一个点的一条横线，并在纸两端注明正负极，将纸两端浸入水中，当液面上升到距离中心1cm时，用事先准备好的酪蛋白溶液在中心点一点，放入电泳仪中，调节电流使每张纸分到的电流为3mA，电压为160V，盖上盖子。40分钟后，取出纸片，用电吹风吹干纸片，用显色剂考马斯亮蓝R试剂显色。
现象：纸片上的横线周围有黄色出现，显色后，点了酪蛋白的地方呈粉红色，纸片为蓝色，但没有观测到其他现象。所以，可认为这次实验失败。
二 结果与讨论
1 . 酪蛋白在牛奶中的存在形式
酪蛋白的等电点为4.8，牛奶的PH值为6.6，因此酪蛋白在牛奶中主要是以负电荷的形式存在。在牛奶中加入酸，当达到其等电点时，酪蛋白便以沉淀析出，而钙仍以离于形式留在溶液中：
Ca2+酪蛋白＋ H + ? 酪蛋白?＋ Ca2+
2 . 本实验应采用新鲜牛奶
本实验所用牛奶应为新鲜牛奶，效果最佳。若让牛奶在室温任意放置，牛奶就会变酸。牛奶中存在着多种细菌，特别是乳酸杆菌。这些细菌与牛奶中的乳糖作用生成有酸味的乳酸。实际上乳糖是由一分子?一D一半乳糖与一分子D一葡萄糖以?一1，4一苷键连结而成的还原性双糖。牛奶中的微生物把乳糖水解了，而且单从乳糖的丰乳糖部分产生出乳酸：
3 . 脂肪对牛奶中酪蛋白和乳糖的分离的影响
脂肪也是牛奶的主要成分之一，约占牛奶的3．9％。在分离酪蛋白时，脂肪会夹杂
在酪蛋白中一起沉淀出来。因此在用乙醚洗涤酪蛋白时，应把块状的酷蛋白捣碎，并用搅拌棒搅拌约 10 min，尽可能除去脂肪。
4 . 搅拌速度对分离的影响：
将牛奶加热时搅拌速度可以快一些，但当滴加HAc时，应该先快搅拌，接近等电点
时，应慢搅拌，当有块状沉淀产生时，停止搅拌。否则，沉淀变成颗粒状，影响后面的过滤速度。
5 . 温度和酸度的影响
虽然文献上报道：将牛奶的pH值调到4.8是最佳的，但实验证明：在温度为10.C左右时，pH要调得更小－4.4左右。而且，当温度从35℃升到45℃和55℃时，酪蛋白凝结最大速率分别以 8．5 * 10-3 s-1增加到17．7 * 10-3 s-1，和 18．9 *10-3 s-1（参考文献：《温度和PH值对酪蛋白凝聚的影响 作者：B.Y.KIM》）。将牛奶加热并加入10％乙酸溶液使酪蛋白沉淀时，注意不要加热过度，也不要加入过多量的乙酸或强酸，因为这些条件会使乳糖水解成葡萄糖和丰乳糖，从而在分离乳糖的实验中导致收得率的降低。
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6. 碳酸钙的作用
使用碳酸钙，主要是中和过剩的乙酸，避免在后面的实验中乳糖在酸性条件下水解，影响收率。乳糖的结晶在析出乳糖晶体的滤液中，滤液应澄清，否则乳糖很难结晶。如果滤液不澄清，可在过滤前在溶液中加入1g助滤剂（如硅藻土）。如果结晶出未的乳糖有杂色，可用活性炭脱色，再进行重结晶。
7.实验心得
本次实验做得不够成功，但是我们也算有了一些小小的收获。对做设计实验有几点建议：a.设计实验应该组织学生先查好资料，再进实验室； b.进行实验时应先定性后定量，扎扎实实做好每一步；
c.试验过程中鼓励同学们多交流经验，讨论方案；同时也鼓励少数能力强的同学尝试不同的实验方案，以做对照；
d.应适当的增加设计实验的学时，让同学们有充足的时间和精力投入实验中来； e.实验的要求要适当提高，结果最好以论文形式上交。 参考文献：
1. 陈忠平： 《牛奶中酪蛋自和乳糖的分离》 中国期刊网 2. B.Y.KIM： 《温度和PH值对酪蛋白凝聚的影响》 中国期刊网 3. 童殿荣 ： 《旋光仪测定新鲜牛乳中乳糖》 中国期刊网 4. 武汉大学： 《物理化学实验》 武汉大学出版社 5. 张宗岩： 《乳糖的物理特性》 中国期刊网
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