天然产物合成生物学体系的优化策略
匡雪君1邹丽秋1孙超1陈士林2 （1. 中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所，北京 100193；2. 中国中医科学院中药研究所，北京 100700） 【摘 要】天然产物是新药研发的重要源泉。天然产物合成生物学通过设计、重构目标化合物的高效生物合成途径，借助宿主改造，利用发酵生产目标化合物，可以有效弥补有机合成化学在复杂天然产物类药物生产方面的不足。虽然合成生物学已经取得了一些进展，但是通过合成生物学技术使目标产物的产量达到工业化生产水平依然是一项非常具有挑战性的任务。综述了天然产物合成生物学体系的优化策略，通过综合运用单个元件、外源代谢途径、底盘系统和发酵条件的优化技术，可以实现生物合成系统的最优化，最大化目标产物的产量，为来源稀缺的复杂天然产物的开发提供持续、稳定、经济的原料供给，推动天然产物类新药的研发。 【期刊名称】生物技术通报 【年(卷),期】2017(033)001 【总页数】10
【关键词】天然产物；合成生物学；优化；底盘
天然产物在药物的发现和研制中发挥着重要作用，以天然产物为基础研制和开发新药一直是化学界和医药界重点关注的领域［1，2］。 天然产物虽然在整个已知化合物中所占比例很小，但以之为基础发展成为新药的比例却很大。1981-2014年间批准上市的1 562个药物中约有一半与天然产物有关；1940-2014年间，国际上共有175个小分子药物被批准用于癌症治疗，其中有85个（即约49%）来源于天然产物或其衍生物［3］。这些有价值的天然产物通常在
原物种中含量很低，化学提取不仅成本高，而且会对环境资源造成破坏；有些天然产物由于含有多个手性中心或结构不稳定，用化学方法全合成难度很大，因此，利用合成生物学技术合成具有药用价值的天然产物受到越来越多的关注。目前，已有学者在工程菌中成功异源合成了萜类化合物青蒿素和人参皂苷、生物碱类化合物诺斯卡品、黄酮类化合物儿茶素和柚皮素等重要天然产物［2，4］。
虽然天然产物合成生物学研究进展迅速，但是使异源合成的目标产物的产量达到工业化生产水平依然是一项富有挑战性的任务。由于底盘细胞是非常复杂的系统，外源途径的导入会使底盘系统产生一系列反应，包括生长速率的调节、热激反应、压力反应、严谨反应等［5］，进而引起质粒的不稳定、细胞的裂解和细胞遗传信息的改变，导致产物无法合成或产量极低。本文提出了天然产物合成生物学体系的优化策略（图1），综合运用单个元件、外源代谢途径、底盘系统和发酵条件的优化技术，对宿主细胞进行改造，人工精确调控外源基因，实现多基因的联合协同表达，使生物合成系统最优化，最大化目标产物的产量，为天然药物的研发提供新的先导化合物。
1 单个元件的优化
合成生物学中的元件包括核糖体结合位点（Ribosome-binding site，RBS）序列、复制起始位点、启动子、终止子、功能蛋白等［6］。单个元件的微调能有效改善基因线路的性能，增加途径中酶基因的表达量和生化反应的效率。 1.1 RBS优化
核糖体结合位点是调节翻译强度的重要元件，人工设计的RBS文库可以方便地通过引物设计和PCR扩增来实现与特定基因的连接，从而在翻译水平上对基因
的表达强度进行调节［7］。可以通过RBS计算器（RBS Calculator）［8］或者RBS 设计器（RBS Designer）［9］对RBS文库的范围和强度进行预测。需要注意的是，此方法一般用于大肠杆菌系统，在酵母中不适用。目前，已有研究者成功在大肠杆菌中通过修改途径中关键酶的RBS优化了抗癌类化合物紫苏醇、抗肿瘤类物质司帕霉素和脱氧紫色杆菌素在工程菌中的产量［10］。 1.2 启动子修饰
启动子是结构基因上游起始转录的一段序列。启动子结构会影响其本身与RNA聚合酶的亲和力，从而影响该启动子对基因的转录效率。启动子的强度决定了结构基因的转录强度［11］。对启动子进行修饰（如对启动子进行突变、改变启动子序列的长度或使用强启动子）可以调控代谢途径中酶基因的表达效率［12］。Redding-Johanson 等［13］的实验表明，使用强启动子能增加甲羟戊酸激酶和磷酸甲羟戊酸激酶的表达活性，进而提高工程菌中紫穗槐-4，11-二烯的产量。Anthony等［14］通过优化启动子的长度来平衡甲羟戊酸激酶（MK）和紫穗槐-4，11-二烯合酶（ADS）基因的表达，使抗癌药物的前体紫穗槐-4，11-二烯（AD）的产量提高了5倍。 1.3 质粒拷贝数优化
增加基因的拷贝数是调节异源基因在底盘系统中表达最常用的工具之一。将基因克隆到多拷贝的表达质粒上增加基因的拷贝数能使基因获得高水平表达，但会给细胞带来更大的生理负担，所以质粒拷贝数不是越高越好［15，16］。Jawed等［17］在大肠杆菌中建立了丁酸的生物合成途径，他们发现质粒的拷贝数能对丁酸的产量产生影响，使用中等拷贝数的质粒能取得最好的效果，使丁酸的产量达到1.5 g/L。
天然产物合成生物学体系的优化策略
