产胞外多糖植物乳杆菌的筛选及粗多糖的活性研究
冯小婉，夏永军，王光强，艾连中* （上海理工大学医疗器械与食品学院，上海 200093）
【摘 要】通过观察乳酸菌菌落拉丝状况并测定其胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）的产量，筛选出1 株所产EPS黏性好、产量高的乳酸菌AR307，经鉴定为植物乳杆菌。为得到更多的胞外多糖，对植物乳杆菌AR307的发酵条件进行优化，确定其在发酵温度32 ℃、发酵时间20 h条件下的产糖量为389 mg/L。在体外实验中，所得胞外多糖具有抑制HT-29肿瘤细胞活性、降低血糖水平的作用。 【期刊名称】食品科学 【年(卷),期】2016(037)013 【总页数】5
【关键词】植物乳杆菌；发酵条件；胞外多糖 引文格式：
冯小婉， 夏永军， 王光强， 等.产胞外多糖植物乳杆菌的筛选及粗多糖的活性研究［J］.食品科学， 2016， 37（13）: 125-129.
FENG Xiaowan， XIA Yongjun， WANG Guangqiang， et al.Screening of exopolysaccharide （EPS）-producing Lactobacillus plantarum and bioactivity of the EPS［J］.Food Science， 2016， 37（13）: 125-129.（in Chinese with English abstract）DOI:10.7506/spkx1002-6630-201613022. http://www.spkx.net.cn
乳酸菌在食品工业中应用广泛，除了具有维持胃肠道正常的微生态平衡、抑制
病原菌的入侵与感染［1］、增强机体免疫力［2］、预防和抑制肿瘤发生［3］、降低胆固醇［4］以及抗氧化［5-6］等作用，乳酸菌胞外多糖因其独特的物理特性及良好的流变学特性［7］，并且安全无毒，已被开发利用。Surayot等［8］研究了乳酸菌 TISTR 1498所产胞外多糖的分子特征和摩尔质量对免疫调节活性的作用，摩尔质量低于7.0×103g/mol的胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）能有效刺激RAW264.7细胞产生促炎介质，部分水解的EPS能通过调节mRNA刺激RAW264.7细胞产生大量NO和各种细胞因子。
乳酸菌胞外多糖是微生物适应环境的产物［9］，但产量低，菌株稳定性差， 提取成本高，制约着大规模工业生产［10］。除与菌种的遗传特性有密切关系外，培养基的成分（碳源和氮源）和生长环境（温度、pH值、培养时间）等都会直接影响乳酸菌胞外多糖的分泌积累［11］，且不同营养条件和环境条件下产生的多糖的化学结构和生理功能也有差异［12］。因此发酵条件的优化，主要包括培养基成分的优化和生长环境因素的优化。本实验从实验室已有菌株中筛选出1 株高产EPS的乳酸菌，并优化其产胞外多糖的发酵条件，制备并研究其胞外多糖活性。
1 材料与方法
1.1 菌株与试剂
菌株：上海理工大学食品生物技术研究所保藏的乳酸菌共10 株。
葡萄糖、淀粉、三氯乙酸、苯酚、浓硫酸、阿卡波糖、3，5-二硝基水杨酸（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）、二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）等均购于国药化学试剂有限公司，为国产分析纯。 1.2 仪器与设备
3-18K型高速冷冻离心机 德国Sigma公司；紫外分光光度计 上海美谱达仪器有限公司；LDZX-30FA型立式压力蒸汽式灭菌锅 上海申安医疗器械厂；多功能酶标仪 美国Molecular Devices公司。 1.3 方法
1.3.1 高产胞外多糖乳酸菌的筛选 1.3.1.1 菌落拉丝法初筛
取－80 ℃保存的10 株菌株，涂布于MRS琼脂培养基中活化。观察菌株在平板上的菌落形态，挑取黏稠且有明显拉丝的单菌落，革兰氏染色并做H2O2酶实验，筛选出革兰氏染色阳性、H2O2酶实验阴性的菌株［13］。将菌株挑入MRS液体培养基培养18～24 h，4 ℃冰箱保藏。 1.3.1.2 粗多糖含量的测定
取20 mL发酵液，加1 mL质量分数为80%的三氯乙酸溶液，4 ℃静置过夜。4 ℃、10 000×g离心20 min，取上清液，去离子水透析3 d，每8 h换水1 次。以葡萄糖为标准，采用苯酚-硫酸法［14］测定粗多糖含量。 1.3.2 菌株的鉴定
将筛选到的高产黏性多糖的优良菌株，采用16S rDNA序列分析方法［15］鉴定。将高产黏性多糖的菌株接入5 mL MRS液体培养基中，37 ℃过夜培养。10 000 r/min离心5 min，弃去上清液。用1 mL无菌水洗涤菌体1～2 次后收集菌体，采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethyl ammonium bromide，CTAB）法提取乳酸菌DNA，并进行聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增。引物使用：27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′
）和1492R （5′-
产胞外多糖植物乳杆菌的筛选及粗多糖的活性研究
