产品无菌检验操作规程

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作业指导书 ×××××××××公司 产品无菌检验 文件编号 版本号 修改次数 页次 0 ×/× 1 目的

通过无菌检验，确保灭菌后产品能够达到无菌的要求。 2 适用范畴

适用于灭菌后医疗器械产品（列举）的无菌检验。 3 检验依据

本厂产品注册标准（编号）

EN1174-1996 医疗器械灭菌产品中微生物数量的评估 《中国药典》（2005年版）

GB14233.2-2005 医用输液、输血、注射器具检验方法第二部分：生物试验方法 GB15980-1995 一次性使用医疗用品卫生标准 4 仪器、设备

百级层流超净工作台、电热干燥箱、电热恒温培养箱、霉菌培养箱、压力蒸汽灭菌器、集菌仪（器）、电子天平、PH计、冰箱、恒温水浴锅、酒精灯、三角烧瓶，接种环、无菌棉签、镊子，试管架，大试管若干等。 5 无菌检验室的环境要求

5.1 无菌检验应在环境洁净度10000级下的局部百级的单向流空气区域内进行。

5.2 缓冲区与外界环境、无菌检验室与缓冲区之间空气应保持正压，阳性对比室与缓冲区之间空气应保持负压。无菌检验室与室外大气之间静压差应大于10Pa。无菌检验室的室温应保持18～26℃，相对湿度：45～65%。

5.3 无菌检验室的单向流空气区、工作台面及环境应定期按《医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法》的现行国家标准进行悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的监测。每年至少检测一次。

5.4 无菌检验过程中应同时检查超净工作台单向流空气中的菌落数：每次操作时在层流空气所及台面的左中右置3个营养琼脂平板，暴露30min，于30～35℃培养48小时，菌落数平均应不超过1CFU/平板。 6 无菌检验前的预备 6.1 器具灭菌、消毒

6.1.1 灭菌：试验过程中与供试品接触的所有器具必须采纳可靠方法灭菌。可经电热干燥箱160℃以上干烤2小时，或置压力蒸汽灭菌器内121℃蒸汽灭菌30分钟后使用（依照灭菌成效验证决定灭菌参数）。所有的灭菌物品不应超过2周即用毕，否则应重新灭菌。

6.1.2 消毒：凡检验中使用的器材无法灭菌处理的，使用前必须经消毒处理。如无菌检验室的试管架、电子天平、工作台面、工作人员的手、橡胶吸头等。可采纳消毒剂浸泡或擦拭。消毒剂应每月更换，以防止产生耐药菌株。

6.1.3 标识：器具的灭菌、消毒后必须做好标识，标明灭菌、消毒时刻和使用有效期。 6.2 人员、物料进入无菌检验室

6.2.1 开启紫外线灯或臭氧发生器进行空间灭菌处理，消毒时刻不得少于30min。 6.2.2 物料进入无菌检验室流程

6.2.2.1 脱包：进入无菌检验室的物品若有双重包装的，需将外包装在传递窗/缓冲间拆除后，传入试验室。

6.2.2.2 消毒：进入无菌操作室的所有培养基、供试品等的外表都应采纳适用的方法进行消毒处理，以幸免将外包装污染的微生物带入无菌检验室。 6.2.2.3 传递：查看所有进入无菌检验室的器具上的灭菌、消毒标识，是否在有效期内。符合要求的经传递窗传入无菌检验室。 6.2.3 人员进入无菌检验室流程

6.2.3.1 更鞋脱衣：在一更区脱去一样区工作鞋，穿上无菌检验室工作鞋；脱去一样区工作服。

6.2.3.2 洗手：第一用肥皂或洗手液在手上揉擦出泡沫，再用流水连续冲洗20秒，洗净泡沫。

6.2.3.3 更衣：在二更区按照从上到下的顺序穿戴无菌工作服（包括衣、帽、口罩等），要求裤子掖在上衣里，口罩掩住口鼻，帽子包裹所有头发。

6.2.3.4 手消毒：用消毒液浸泡双手5秒以上或用浸过消毒液的棉球擦拭双手。消毒液可用洗必泰、新洁尔灭、碘伏、75%酒精等。 6.2.3.5 人员进入：经缓冲间进入无菌检验室。

6.2.4 人员进入无菌检验室后，进一步用消毒液擦拭工作台面，戴无菌手套。 7 无菌检验操作要求

7.1 全过程必须严格执行无菌操作，防止微生物污染。

7.2 使用玻璃器皿应轻取轻放，幸免破旧，以防培养物扩散。

7.3 所有操作均应在近火焰区进行，且不得有大幅度或快速动作，以免搅动空气中的尘埃微粒。

7.4 使用金属接种器具时，用前、用后均需灼烧灭菌。

7.5 在接种培养物时，动作应轻、准，防止培养物溅出，产生汽溶胶，造成污染。 7.6 操作过程中所有的带菌物品，用后均应作消毒、灭菌处理。可在检验过程中随用随时放入消毒液缸内浸泡或消毒桶内，或在检验完成后经传递窗传至一样区，赶忙用压力蒸汽灭菌锅121℃灭菌30分钟。 8 培养基制备

8.1需气菌、厌气菌培养基（硫乙醇酸盐流体培养基）的制备 8.1.1 所用试剂

酪胨（胰酶水解）15.0g 酵母浸出粉5.0g 葡萄糖5.0g 氯化钠2.5g L-胱氨酸0.5g 新配制的0.1%刃天青溶液1.0ml 硫乙醇酸钠0.5g 琼脂0.75g （或硫乙醇酸）（0.3ml） 水1000ml 8.1.2 制备

除葡萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微温溶解，调剂pH为弱碱性，煮沸，滤清，加入葡萄糖和刃天青溶液，摇匀，调剂pH为7.1±0.2。 8.1.3 硫乙醇酸盐流体培养剂氧化层的颜色要求

在供试品接种前，培养基氧化层的高度不得超过培养基深度的1/5，否刚需经100℃水浴加热到粉红色消逝（不超过20分钟）迅速冷却，只限加热一次，并应防止被污染。 8.2 霉菌培养基（改良马丁培养基）的制备

8.2.1 所用试剂 胨5.0g 磷酸二氢钾1.0g 酵母浸出粉2.0g 硫酸镁0.5g 葡萄糖20.0g 水1000 ml 8.2.2 制备

除葡萄糖外，取上述成分混和，微温溶解，调剂pH值约为6.8，煮沸，加葡萄糖溶解后，摇匀，滤清，调剂pH为6.4±0.2。

8.3 还可使用按处方生产的符合规定的脱水培养基，按照使用讲明书配制。 8.4 培养基配制后应尽快灭菌，幸免微生物繁育。一样采纳高压蒸汽121℃灭菌30分钟。 8.5 制备好的培养基应在2～25℃储存，在3周内使用。 8.6 培养基的无菌性检查

每批配制的培养基均应进行无菌性检查（可与产品无菌检验同步进行）。检查时，每批培养基随机取许多于5支（瓶）培养14天，应无菌生长。 9 稀释液、冲洗液的制备 9.1 0.1%蛋白胨水溶液

取蛋白胨1.0g，加水1000ml，微温溶解，滤清，分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30分钟后，于4℃储存备用。 9.2 pH7.0 氯化钠-蛋白胨缓冲液

取磷酸二氢钾3.56g、磷酸氢二钾7.23g、氯化钠4.30g、蛋白胨1.0g，加水1000ml。微温溶解，滤清，分装后置入压力蒸汽灭菌器内，121℃灭菌30分钟后，于4℃储存备用。

9.3 浸提介质：9g/L无菌氯化钠溶液，可直截了当从有证单位采购大输液。 10 对比菌液制备

10.1 无菌检验所用的菌株传代次数不得超过5代。 10.3 采纳平皿计数法测定活菌数。 11 无菌检验培养温度

硫乙醇酸盐流体培养基，置30～35℃培养。 改良马丁培养基，置23～28℃培养。 12 无菌检验

12.1 如产品注册标准中明确“产品应通过一个确认过的灭菌过程”，则执行12.1项下各项。

12.1.1 放样

每个灭菌批次按已验证的灭菌工艺，在灭菌柜内相应的位置放置适量菌片，灭菌后对菌片进行无菌检验。 12.1.2 菌片贮存

灭菌前、后菌片应按菌片讲明书规定条件储存。（REVEN公司菌贮存温度为15～27℃） 12.1.3 接种

开启超净工作台单向层流，在此环境下，分不将灭菌后的菌片成对放入已灭菌的硫乙醇酸盐流体培养基中。同时以金黄色葡萄球菌作阳性对比，以未接种的硫乙醇酸盐流体培养基和未接种的改良马丁培养基作为阴性对比。 12.1.4 培养

阳性对比管于30～35℃细菌培养箱培养48～72小时。 其余硫乙醇酸盐流体培养基于30～35℃培养7天。 改良马丁培养基于23～28℃培养7天。

12.1.5 结果判定

培养后，阳性对比管有菌生长，阴性对比和被检样品未见需气菌、厌气菌和霉菌生长的为合格。

12.2 如产品注册标准中明确产品应进行无菌检验，则执行12.2.1～12.2.5。 12.2.1 抽样

依照各自的产品注册标准和相应产品出厂检验规程的规定，对成品库内的产品进行抽样。一样同一个灭菌批产品检验3～11个单位供试品。 12.2.2 供试液预备

优先采纳将供试品或其有代表性的各部分直截了当投放入培养基内培养的方法，如供试品不适宜直截了当投放，可按下列方法制备供试液，应使浸提介质充分洗提供试品的浸提表面，供试液制备应按无菌操作法进行，在制备后2小时内使用。 依照供试品具体特性选择下列方法：

2

a) 管类器具：按管内表面积每10cm流过管内腔1ml浸提介质，流量约为10ml/min，收集到无菌的容器内。

b) 容器类器具：按容器内表面积每10cm2加入浸提介质1ml的比例，振摇数次。 c) 实体类器具：实体类器具按表面及每10cm2加入浸提介质1ml，振摇数次。 收集上述冲洗液或浸提介质于无菌容器中。 12.2.3 接种

12.2.3.1 薄膜过滤法：优先采纳封闭式薄膜过滤器（集菌器），也可使用开放式薄膜过滤器。滤膜孔经不大于0.45μｍ。滤器和滤膜使用前应采纳适宜的方法灭菌，或直截了当采纳无菌集菌器。

a、如采纳封闭式薄膜过滤器，取一副三联式集菌器，将供试液通过集菌仪过滤，使通过每只培养管的量差不多平均。然后通过集菌仪一只加120ml改良马丁培养基，另两只分不加入120ml硫乙醇酸盐培养基（其中一只做阳性对比，内加金黄色葡萄球菌液1ml）。另取一副二联集菌器，用同批的冲洗液或浸提介质120ml通过集菌仪过滤（每只约50ml），同法一只加硫乙醇酸盐培养基120ml，另一只加改良马丁培养基120ml分不作阴性对比。 b、如用一样薄膜过滤器，将供试液过滤后取出滤膜，将其剪成3等份，分不置于含50ml硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中两份作检验，一份作阳性对比。 12.2.3.2 直截了当接种法：适用于一次性使用注射针、一次性使用静脉输液针（包括输液器、输血器、注射器配套使用注射针）。

a、敷料供试品：取规定数量，每个包装以无菌操作拆开，于不同部位剪取约120mg或1cm×3cm的供试品，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。

b、无菌针头：直截了当投入含15ml以上硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中。

c、一次性使用的材料：拆散或切成小碎断，接种于各管足以浸没供试品的适量培养基中。

供试品按规定量分不接种至各含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作阳性对比。

每个容器中培养基的用量应符合：接种的供试品体积不得大于培养基体积的10%，或培养基的装量足以浸没供试品。

每管培养基的最低用量——硫乙醇酸盐流体培养基每管装量许多于15ml，改良马丁培养基每管装量许多于10 ml. 12.2.4 培养、观看

上述含培养基的容器分不置规定温度的恒温培养箱中，除阳性对比管培养48～72小时