文献1详解②▕ 如何探索研究目的LNCRNA
原创2016-08-17小诺
欢迎关注我们的文献详解，继上期作者发现了抗舒尼替尼关键lncRNA后（←点击查看），作者接下来对lncARSR进行了表达调控机制、功能研究，具体方法如何？请看↓
如何探索研究目的LNCRNA
一、探究lncARSR表达调控机制
1. 总结经验，大胆设想
前期探索发现，lncARSR基因组在抗舒尼替尼肾癌细胞中没有增加（见下图O），同时DNA甲基化酶抑制剂并不影响lncARSR
在肾癌细胞中的表达（见下图P）。
这两个结果说明敏感性肾癌细胞转化为抗舒尼替尼肾癌细胞并不能影响lncARSR基因的拷贝数，同时DNA甲基化酶并没有参与
lncARSR在肾癌细胞中的表达，作者认为抗舒尼替尼肾癌细胞的lncARSR表达升高与基因突变和DNA甲基化修饰改变无关。
2. 过表达验证生信分析预测
接下来，生物信息学分析预测结果显示，lncARSR基因上游启动子序列（-2000-200bp）可能存在3个FOXO1和FOXO3a的结
合位点（见下图G）。因此作者猜想FOXO1和FOXO3a可能参与lncARSR的表达，而且是以转录调控的方式。
为验证这个猜想，作者首先向抗舒尼替尼肾癌细胞分别转染可持续激活FOXO1或FOXO3a的质粒，上调FOXO1或FOXO3a
的表达，发现可抑制lncARSR的表达（见下图Q），同时发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂trichostatin A 和sodium butyrate可消除这种抑制效应（见下图R）。
因此作者猜想FOXO1或FOXO3a可能通过募集一种组蛋白去乙酰化酶来发挥其抑制效应。
3. IHC、CHIP证实调控
免疫荧光组化实验表明FOXO3a在抗舒尼替尼肾癌细胞中比亲本细胞更少聚集在细胞（见下图S），此结果解释了抗舒尼替尼肾
癌细胞中lncARSR表达比亲本细胞高的原因可能是FOXO3a是需进入细胞核才能发挥对lncARSR的影响。
进一步采用CHIP试验方法检测抗舒尼替尼细胞和亲本细胞中FOXO1和FOXO3a与lncARSR启动子结合情况，发现FOXO1
和FOXO3a与lncARSR启动子结合量高，而且丰度在抗舒尼替尼细胞中明显下降（见下图G和T）。最终结果表明FOXO1和FOXO3a以转录调节的方式参与了lncARSR的表达调控。
4. siRNA实验验证
作者根据已有报道AKT可促进FOXO1和FOXO3a的磷酸化并滞留在细胞质，最终导致FOXO1和FOXO3a被蛋白酶体降解，
认为这一现象也可能出现在lncARSR的表达调控中。作者采用AKT-siRNA敲除抗舒尼替尼肾癌细胞AKT，发现可抑制lncARSR的表达（见下图U），同时促进FOXO1和FOXO3a表达，增强和转运(见下图V)。
综合以上结果，表明抗舒尼替尼肾癌细胞中lncARSR表达上调的部分原因是AKT激活FOXO1和FOXO3a，导致FOXO1和
FOXO3a被降解，失去对lncARSR表达的抑制效应，最终导致lncARSR表达上调。
二、探究高表达的lncARSR是否必需
作者首先采用慢病载体shRNA敲除抗舒尼替尼肾癌细胞的lncARSR（见下图W），发现沉默lncARSR可造成舒尼替尼半抑制
率下降和舒尼替尼处理抑制抗舒尼替尼肾癌细胞锚定依赖生长（见下图H，I，X，Y），同时可导致STAT3， AKT和ERK信号通路被抑制，促进舒尼替尼处理后的肾癌细胞凋亡（见下图J和Z）。这些结果说明抑制lncARSR的表达可恢复抗舒尼替尼细胞对舒尼替尼的敏感性。
最后动物体内实验进一步验证，敲除lncARSR的抗舒尼替尼肾癌细胞7Su3rd移植体，对舒尼替尼的敏感性显著增强，而再次具
有抗性是在4个月以后（见图K）。
以上结果说明高表达的lncARSR是肾癌细胞具有抗舒尼替尼特性所必需的。
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