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绿色荧光蛋白(GFP)基因的克隆、表达和粗提取
南方医科大学
2011预防医学（卫生检验检疫）
摘 要
目的：研究绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因在大肠杆菌中的基因克隆与重组表达，以及对其进行粗提取。 方法：从E.coli DH5ɑ中用碱提取质粒的方法提取质粒pEGFP-N3和质粒pET-28a。然后用质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳对已经提取的产物进行电泳，确定从大肠杆菌中成功提取了质粒。再用限制性内切酶BamHI和NotI对成功提取的质粒进行酶切，并对酶切后的质粒进行琼脂糖凝胶电泳，用以确定已经提取了GFP基因。将含有GFP基因的质粒转化到感受态细胞E.coli BL-21中，用LB培养基对转化后的E.coli进行扩大培养。用IPTG诱导GFP基因表达可以看到浅绿色菌落。最后对绿色荧光蛋白进行粗提取。 结论：本实验有助于学生掌握最基本的分子生物学实验技术，为进一步的实验奠定基础。
关键词：绿色荧光蛋白 基因克隆 重组表达 转化 粗提取
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目录
1 前言 .......................................................................................................................................... 3 2 实验目的 .................................................................................................................................. 4 3 实验设备 .................................................................................................................................. 4 4 材料及试剂 .............................................................................................................................. 5 5 实验操作步骤 .......................................................................................................................... 5
5.1 操作流程 .........................................................................................................................................................5 5.2 质粒DNA的分离与纯化 ...............................................................................................................................6 5.2.1 质粒的培养 ..............................................................................................................................................6 5.2.2 质粒的DNA的碱提取法 ........................................................................................................................6 5.2.3 质粒DNA的鉴定与纯化 ........................................................................................................................7 5.3 酶切及连接 .....................................................................................................................................................7 5.3.1 双酶切 ......................................................................................................................................................7 5.3.2 回收酶切产物（采用DNA回收试剂盒进行回收）.............................................................................8 5.3.3 连接 ..........................................................................................................................................................9 5.4大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 ..............................................................................................................9 5.4.1 LB（Luria-Bertain）液体和固体培养基的配制（参考附录） ............................................................9 5.4.2．感受态细胞的制备 (CaCl2法) .............................................................................................................9 5.4.3 转化涂板 ................................................................................................................................................ 10 5.5 GFP蛋白的诱导表达 .................................................................................................................................... 10 5.6 绿色荧光蛋白的粗提取 ............................................................................................................................... 11
参 考 文 献 ............................................................................................................................... 11 附 录 ..................................................................................................................................... 12
1 LB培养基的配制： ......................................................................................................................................... 12 2. 溶液Ⅰ ............................................................................................................................................................. 12 3. 溶液Ⅱ ............................................................................................................................................................. 12 4. 溶液Ⅲ（100ML）........................................................................................................................................... 12 5. DNASE-FREE RNASE A ..................................................................................................................................... 12 6.TE缓冲液（PH8.0） ....................................................................................................................................... 12 7. 20×TBE ............................................................................................................................................................ 13 8. GENEFINDER-溴酚蓝上样缓冲液 .................................................................................................................... 13 9．PEGFP-N3质粒全图谱 .................................................................................................................................. 13 10．PET-28A质粒全图谱 ................................................................................................................................... 14
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1 前言
绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）是一类存在于包括水母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时，GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。1962 年，下村修等分离纯化了水母中发光蛋白水母素，并发现一种绿色的荧光蛋白。1974 年，他们分离得到了这个蛋白，当时称绿色蛋白，以后称绿色荧光蛋白(GFP)[1]
GFP 作为一种新的报告基因，其优点在于①荧光强度高，稳定性高；②GFP 分子量小，易于融合，适用于多种转化方式，对受体无毒害，安全可靠；③不需要反应底物与其他辅助因子，受蓝光激发产生绿色荧光，尤其适用于体内的即时检测；④GFP 不具有种属依赖性，在多种原核和真核生物细胞中都表达；⑤通过替换一些特殊氨基酸，可以使之产生不同颜色的光，从而适应不同的研究需要。近年来广泛用于基因的表达与调控、蛋白质的定位、转移以及相互作用、信号传递、转染与转化，以及细胞的分离与纯化等研究领域[ 2～3] 。采用GFP 作为标记基因，可直接收集转化细胞供实验，缩短了筛选时间、减少对细胞活性的影响并可作为活体标记，为研究发育的基因调控和分子机制提供了一种简洁有效的手段[ 4、5 ] 。采用基因工程手段生产GFP标记的方法，可建立一种简便、快速的免疫诊断技术[6] 。
质粒转化进入大肠杆菌（Escherichia coli）感受态细胞是分子克隆的关键步骤[7]，是基因克隆以及DNA文库构建等研究中一项重要的常规操作。目前，感受态细胞的制备主要采用CaCl2 法，该方法操作简单、容易掌握、重复性好、转化率高，可广泛应用于一般的实验室。其原理是Ca2+ 破坏细胞膜上的脂质阵列，并与膜上多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物以利于外源DNA的渗入[8]。
大肠杆菌是第一个用于重组蛋白生产的宿主菌，它不仅具有遗传背景清楚、培养操作简单、转化和转导效率高、生长繁殖快、成本低廉、可以快速大规模地生产目的蛋白等优点[9]。而且其表达外源基因产物的水平远高于其它基因表达系统，表达的目的蛋白量甚至能超过细菌中蛋白量的30%，因此大肠杆菌是目前应用最广泛的蛋白质表达系统
[10]
。大肠杆菌表达系统是目前最常用的外源蛋白表达系统,大肠杆菌由于遗传背景清楚、
易操作,以及有大量可供选择的克隆或表达载体,使之成为人们克隆表达外源基因的主要菌株[11]。
随着科研的进展，构建出了多种具有不同特点的表达载体和工程菌株，以满足表达
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