激光共聚焦显微镜使用中的常见问题及维护分析

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激光共聚焦显微镜使用中的常见问题及维护分析

作者：宋华芝

来源：《现代商贸工业》2011年第15期

摘 要：激光扫描共聚焦显微镜从上世纪八十年代起，被广泛地应用于分子细胞生物学、生物医学、遗传学等研究领域。但复合软件及多功能操作界面的使用对于初学者来说比较复杂，总结了操作过程中的常见问题，并提出了解决办法。对激光扫描共聚焦显微镜这项技术的使用具有现实的参考价值。

关键词：激光扫描共聚焦显微镜；荧光；图像 中图分类号：TB 文献标识码：A

文章编号：1672-3198（2011）15-0293-01

激光扫描共聚焦显微镜与普通显微镜相比，激光共聚焦采用了能到达最高分辨率及重复性的无色差扫描技术，能产生真正具有三维清晰度的图像，而且还可以处理活的标本并不对标本造成物理化学特性的破坏。

我室引进的Leica TCS SP2型激光共聚焦配有全自动DMIRBE2新型光学显微镜系统；Leica TCS SP2 AOBS扫描头；四通道荧光共焦检测器及一个投射光DIC检测器；八通道AOTF调节器；电脑主机及双屏显示器。可进行组织和细胞的微分干涉及荧光的断层扫描；多重荧光的断层扫描及重叠；实时动态扫描及其动态构建；组织与细胞的三维动态结构构建；荧光共振能量转移的分析（FRET）；图像漂白后的荧光修复（FRAP）等。功能强大，性能优良。但复合软件及多功能操作界面的使用对于初学者来说有些复杂，操作过程中多会出现以下问题。

1 扫描最终图像清晰度不高 造成此类问题的原因主要有两个：

（1）物镜和ZOOM值选用不正确。初学使用者大多喜欢选用10X物镜后，再将ZOOM值调到所需要的最大值。通过ZOOM值的增大确实可以将图像放大，有助于看清图像的细节，但是ZOOM的增大是有限定的，这取决于物镜的倍率。例如在10X物镜下，ZOOM值超

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过10就没有意义了，而且ZOOM值的增大属于电子放大，放大倍数越高，清晰度越差。所以在所观察的样本形态体积较小的情况下，多采用高倍物镜（例如63X水镜或油镜），再适当调整ZOOM值，ZOOM值以不超过2为佳。

（2）误将Z-Position旋转球的功能和显微镜焦距微调旋转器的功能等同。在准确调焦的基础上，通过Z-Position旋转球的左右调节，可以观察到目标样品图像由Z轴距离变化而引起的图像清晰度的改变，感觉上和通过调焦使图像变清晰一样。因此很多使用者在没有调焦准确的情况下，直接使用-Position旋转球来调整图像清晰度而导致成像模糊。 2 扫描背景强，图像质量差

解决这个问题的关键在于要根据样品的制备质量选取合适的针孔大小，调整激光管电压、光电倍增管功率、信噪比等参数到最佳状态。这些参数或设置有非常密切的关系，选择时应该综合考虑；或者是在扫描时使用Aver键和Li.Ai.键（即简单的数学平均方法）进行图像平滑减噪，另外一个方法是在此基础上，图像扫描完成后通过LCS软件中的图像处理功能键来调节亮度、对比度和进行灰度校正以及通过基线校正去除噪音，使图像质量最佳化。还有一种明场出现环状波纹背景的情况是由于操作者在使用显微镜观察荧光样品后，没有将荧光滤镜退出并切换到扫描状态所致。此时只需要转动调节轮至Scan即可。 3 串色

在使用多种荧光染料标记样品时或是样品本身有很强的自发荧光时，串色的现象就很容易发生。串色又分为两种情况：（1）两种荧光染料的激发光谱没有重叠，但是吸收光谱有重叠。这类串色可以通过顺序扫描（又称序列扫描）来完成：即先使用一种荧光染料的激发光扫描一张图片，再使用另外一种荧光染料的激发光扫描第二章图片。（2）两种荧光染料的激发光谱和吸收光谱都有重迭，这种情况只能通过光谱扫描解决。 4 多荧光通道扫描图像的保存及标尺数值的取整

在多通道扫描图像存盘时，系统默认以不同单通道的颜色分别保存。为了便于直观的观察各种荧光在不同部位的表达，我们还需要一张各种荧光叠加的合并图像，此时点击Overlay键即可。在单次扫描图像完成后，系统自动生成的标尺数值多数情况下为非整数，即使在图像保存前修改为整数，但一经后续扫描，前幅图像中修改过的标尺数值又会恢复到默认的非整数值。解决这个问题也需要用到Overlay功能键，即在单次扫描完成并将标尺数值修改取整后，点击Overlay键显示合并图像，再右键点击选中图片，使之生成Snapshot图像即可。这两点是初学使用者很容易忽视的。

5 在图像扫描完成后，各种参数忘记复位

特别是电子放大扫描以后，很多操作者都忘记将ZOOM还原，这就造成在下一个样品扫描时无法在显示屏上观察到目标样本。

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6 激光共聚焦显微镜的日常维护问题

作为使用频率非常高的大型精密仪器，激光共聚焦显微镜的日常保养维护非常重要。（1）设立专门的实验室，实行专人管理。室内要求遮光，有稳定的电源电压。激光共聚焦显微镜的工作温度应该恒定在22摄氏度左右。（2）注意防尘。为了保持良好的工作状态，延长仪器的使用寿命，激光共聚焦显微镜的工作环境要求清洁、干燥、远离辐射源。每次使用完毕后，都要做好台面以及目镜、物镜等容易被污染的光学部件的清洁工作。（3）严格按操作规程使用，避免因使用不当造成损坏。扫描后的图片及数据严禁用硬盘拷贝，只能通过光盘刻录，避免激光共聚焦显微镜系统感染病毒。（

4）上机操作人员必须事先经过培训和考核。