人类EGFR基因突变荧光 PCR检测试剂盒说明书
【产品名称】
通用名称：人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒
英文名称：Shuwen? Human EGFR Gene Mutation Detection Kit for Real-Time PCR
【包装规格】
7测试/盒
【预期用途】
EGFR是一种细胞膜表面的糖蛋白受体，具有酪氨酸激酶（
Tyrosine Kinase，TK ）活性，是原癌基因
c-erbB-1 （ HER-1 ） 的表达产物。EGFR 的主要信号转导途 径有：PI3K-PDK 通路， RAS-RAF-MEK-ERK-MAPK 通路，PLC- Y通路，JAK-STAT通路。通过这些途径，将胞外信号转化为胞 内信号，从而有效应对外界的信号刺激，调节细胞的生长、增殖、分化，抑制细胞的凋亡。
节通过多种机制促进细胞恶性转化，包括受体的过度表达、突变、生长因子 的磷酸酶失活，其中涉及肿瘤发生和进展的机制中最常见的是
EGFR异常调
-受体自分泌环的活化以及特定
EGFR的基因突变和过度表达。
EGFR基因位于7号染色体短臂7pl2-14区，由28个外显子组成。其突变主要发生在 EGFR酪氨酸激酶的 ATP结合位点的编码区（第18-20外显子），研究表明，EGFR酪氨酸激酶抑制剂（例如吉非替尼、厄洛替 尼和埃可替尼等）疗效与EGFR基因的突变有密切的相关性。目前已经报道大约有30种突变与吉非替尼的药 物反应相关，主要是19外显子上的缺失突变和21外显子上的L858R的点突变。外显子19上747-750位氨基酸 的大约20种缺失约占所有突变的 45%，其中以两种delE746-A750（2235_2249del15和2236_2250del15）最为常 见，占到外显子19缺失总数的75%;外显子21上 L858R的点突变占所有突变的45%左右；外显子18的3种点 突变（G719X ）约占5%;外显子20的突变占1%左右。另外研究发现外显子 20上的T790M突变与酪氨酸激酶 抑制剂药物的耐药性相关。
本试剂盒以肿瘤DNA为检测样本，提供EGFR基因突变的定性检测。本试剂盒仅为临床医生肿瘤靶向 治疗药物的选择提供参考，具体临床应用时须结合实际情况进行判断，不能以本试剂盒检测结果作为临床 诊断的唯一依据。 【检测原理】
本试剂盒结合特异性引物和 TaqMan探针技术，用实时荧光PCR方法检测DNA样品中的EGFR突变基因。 利用特异性引物对突变靶序列进行扩增，同时阻滞野生型的扩增，通过
TaqMan探针对扩增产物进行检测，
使得突变基因得到扩增而野生型基本不扩增，从而达到高检测特异性和高灵敏度。 【主要组成成分】
本试剂盒具体包含组分如表 1
表1 编号 1 2 3 4 5 6 7 8 组分 19-Del （1）检测反应液 19-Del （ 2）检测反应液 S768I检测反应液 20-Ins检测反应液 T790M检测反应液 L858R检测反应液 L861Q检测反应液 G719X检测反应液 外控检测反应液 r-Taq 酶 阳性对照DNA 份数 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 体积（丄） 150 150 150 150 150 150 150 150 150 30 100 500 无菌超纯水 【储存条件及有效期】
避光，-20'C以下保存，避免反复冻融（不要超过5次），有效期6个月。
【适用仪器】
ABI 7300， ABI 7500， ABI 7900， ABI StepOne，ABI StepOne Plus， Rotor-Gene Q
【样本要求】
本试剂盒可以检测从新鲜组织及 FFPE组织中提取的DNA，DNA质量及浓度影响检测的特异性和灵敏 度。DNA的质量与样本保存时间、样本组成、
DNA提取方法密切相关；而且所采集的临床样本中正常组织
细胞的混杂程度也不同，因此对样本做如下要求：
1、 新鲜标本的制备过程中， 术后标本取下后应立即放入-20C以下冰箱中保存；石蜡包埋组织制备过程中，
术后标本应在1个小时内放入10%中性缓冲福尔马林溶液中固定，用量应为组织块的 间应在6-48小时之间；
2、 新鲜组织样本，要确保含有肿瘤细胞大于
1%,尽量减少正常组织、间质及坏死组织，推荐使用商业化
4-20倍，固定时
试剂盒提取DNA（AXYGEN ，QIAGEN等公司产品）。提取的DNA用分光光度计检测DNA纯度， A260/A280在1.6-2.0之间，如果不能立即检测请置于 -20 C保存。
3、 FFPE组织样本，要确保含有肿瘤细胞，尽量去除坏死组织及石蜡边缘，推荐使用商业化试剂盒提取
DNA（QIAamp DNA FFPE Tissue Kit）。提取的 DNA 用分光光度计检测 DNA 纯度，A260/A280 在 1.6-2.0 之间，如果不能立即检测请置于 -20C保存。FFPE组织样本保存年限尚未超过 3年。 4、 样本切片规格要求为：横切面面积至少
6mnX 6mm，厚度10 pm，3片，如果切片面积小请适当增加切
5-10ng/ p。
片数。最终提取的DNA用100让-200让水溶解，分光光度计检测浓度后，稀释或浓缩成
【检验方法】
本试剂盒可以进行5人份的检测反应，并为每个样本额外提供一个参照基因扩增反应，
用于估测样本实
际DNA的浓度。建议每批次实验都检测一个阳性对照 （positive control）和一个无模板阴性对照（NTC）。建议 根据实验条件进行分区操作，如样品处理区，反应液配制区等。具体操作步骤如下： 1.
将试剂盒中所有组分冰上融化， 涡旋混匀并短暂离心，放置于冰上。［注意：试剂盒中的所有试管在开 盖前均应短暂离心，以免粘在管口或管盖上的试剂在开盖时被污染。
2.
］
每批实验根据待检测样本数、一个阳性对照、一个阴性对照，同时计算并分别配制1-8号反应液。每个 反应液所需反应数=待测样本数 + 2（—个阳性对照、一个阴性对照），而每个反应所需反应液19.7 JL， 需r-Taq酶0.3丄，即从1-8号反应液中分别取（19.7 ＞反应数）此于对应编号的1.5EP管，再分别加入（0.3 X 反应数）pL的r-Taq酶。［注意：由于取样误差，请根据情况适当多配置
0.3个反应即可。］
3. 4.
将配制好的混合液轻轻充分混匀，并按照每管 20 pL分装到每个PCR反应管中。
然后向每个反应管中加入5此待检测DNA、或阳性参照、或水（试剂盒提供）。待检测样本最佳浓度范 围为5ng/ pL-10ng/ pL，即每个反应管中有效 DNA总量为25-50ng。
5. 短暂离心消除反应管中的气泡，将 PCR反应管放入PCR仪。样本在PCR反应板中的布局可参见表 2
表2建议布局 突变 1 2 3 4 5 6 7 6. 19-del (1) 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD NTC 19-del (2) 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD NTC S768I 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD NTC 20-Ins 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD NTC T790M 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD NTC L858R 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD NTC L861Q 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD NTC G719X 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD NTC 外控 样品1 样品2 样品3 样品4 样品5 STD NTC 打开操作软件，设置PCR扩增程序为 Stagel： 95°C 5min
Stage2: 95 C 20s, 57 C 32s , 5个循环
人类EGFR基因突变荧光PCR检测试剂盒说明书讲课讲稿
