一、 试剂
1、 培养基
新买的培养基可直接使用，使用前加FBS(胎牛血清)至10 %终浓度(250mL培基中加入25mL血清)。
自配的培养基使用前需进行无菌检测。 配制过程：
（1）取出两张0.22μm微孔滤膜（上海半岛公司生产），用超纯水淋洗后再浸泡其中数小时。
（2）将滤器与试剂瓶洗净烘干。
（3）取出浸泡好的滤膜，组装滤器，包扎纱布与牛皮纸，高温高压灭菌滤器与试剂瓶。
（4）完成灭菌，待冷却后取出滤器和试剂瓶转入超净台中，组装滤器，连接好恒流泵，紫外灭菌半小时。
（5）灭菌期间取一袋培养基粉末溶于约980-990 mL超纯水中（注意超纯水冲洗包装袋1-2次，防止粉末残余），按产品说明添加所需的药品，搅拌溶解（注意用保鲜膜封口）。
（6）pH计测培养液pH（pH计使用前需进行校准，同时清洗探头），用1 M HCL或1 M NaOH将pH调整至合适的数值。 （7）培养液定容至1000 mL。
（8）将培养液转入灭菌好的超净台中，恒流泵以橡皮管连接培养液，玻璃钟罩拆开牛皮纸与纱布后过火并连接试剂瓶（瓶口注意过火）。 （9）打开恒流泵，调整橡皮管的培养液抽取方向，开始过滤。
（10）当滤器下方橡皮管中出现培养液时，以止血钳夹住橡皮管，将滤器上部的气阀旋松；待气阀处溢出培养液后，拧紧气阀，取下止血钳，开始过滤。 （11）过滤开始和结束时分别取5 mL培养液转入小方瓶中，放入培养箱中检测（48 h），过滤好的培养液试剂瓶注明配制日期、培养基名称和配制者姓名，放入4 ?C冰箱中保存。
（12）取出恒流泵与滤器，将超净台清理干净，注意将滴撒有培养液的地方擦拭干净。
（13）拆开滤器，观察滤膜有无破损（若破损此次过滤作废，需重新过滤），清洗滤器。
（14）无菌检测合格后，方可添加血清使用。 2、 胰酶
按配方（0.25 g胰酶粉末与0.03 g EDTA溶于100 mL超纯水，NaHCO3溶液调节pH至7.6-7.8）配制胰酶溶液后，在超净台中用0.22 μm针头过滤器过滤分
装无菌试剂瓶或离心管，4 ?C冰箱保存使用，其余-20 ?C冰箱保存。 3、 PBS
按配方（8.5 g NaCl，0.2 g KCl，2.85 g Na2HPO4-12H2O，0.27 g KH2PO4）配制1000 mL溶液，pH调至7.2左右，转入试剂瓶中，包扎好瓶口与瓶盖，高温高压灭菌。灭菌完成后，在超净台中盖好瓶盖，放入干净处保存。 4、 DMSO: 二甲基亚砜
购买的DMSO（Sigma公司生产，100 mL装）为无菌包装，可直接使用，使用前将其分装到15 mL无菌离心管中，放入干净处储存。 5、血清
目前实验室血清使用的是购自Hyclone的胎牛血清（FBS，南美血缘，500 mL液体），为冰冻状态。购置后在-20 ?C冰箱中冻存，使用前置于4 ?C冰箱中解冻（按产品说明和使用需要，如需灭活则置于56 ?C恒温水槽中灭活半小时）。解冻的FBS转入超净台中，用无菌移液管将其分装到50 mL离心管中，标明FBS与分装日期，按使用量添加FBS到培养液中，其余放入-20 ?C冰箱冻存。
由于现在Hyclone的产品在中国市场比较混乱，出现一些假冒产品，且在肿瘤细胞的培养过程中使用新生牛血清亦可达到同样的培养效果，拟以后购买新生牛血清（Gibco产）；若需用到胎牛血清，则购买Hyclone FBS（新西兰血缘）。 6、 MTT
称取0.1044 g MTT粉末放入洗净的烧杯中，添加20 mL PBS溶解（试剂配制终浓度为5 mg/mL），转入超净台中用0.22 μm无菌针头滤器过滤至离心管中，过火盖盖后注明试剂名称、日期与使用者，以锡箔纸包裹住置于4 ?C冰箱中避光保存。 7、双抗
称取0.12 g青霉素G钠和0.31 g链霉素硫酸盐，加入10 mL PBS溶解，转入超净台中用针头滤器过滤至无菌离心管中，过火盖盖后注明试剂名称、日期与使用者，使用时按1:100比例加入培养基中。 二、耗材 1、细胞培养瓶
目前实验室中所用的细胞培养瓶为Corning公司生产的一次性塑料培养瓶（25 cm2和75 cm2两种规格），为无菌包装，可直接使用。
现有玻璃方瓶（购自中科院上海实生生物技术有限公司），使用前需进行预处理清洗。清洗方法为：
（1） 将玻璃方瓶置于酸缸中浸泡过夜，以中和玻璃表面碱性物质。使用后
的玻璃方瓶应立即浸入清水中，避免器皿内蛋白质干涸后粘附于玻璃
上导致难以清洗，浸泡一段时间后转入酸缸中。浸泡时应将器皿完全浸入水中，使水浸入器皿内而无气泡空隙遗留。
（2） 第二天取出玻璃方瓶，先用流水冲洗三次，再用超纯水冲洗三次，烘
干备用。
（3） 高温高压湿热消毒，为保证消毒效果，灭菌时不应装得太满，以便灭
菌锅内气体流通。
2、离心管
目前细胞间所用的15 mL和50 mL 离心管均为Corning公司生产的，为无菌包装，可直接使用。
同时拟购买一批国产离心管（10 mL规格），按不同要求选择使用。 3、移液管
目前有可重复使用的玻璃移液管（需高温高压灭菌）和一次性的塑料移液管（Brand公司旗下Nunc产品，无菌包装，可直接使用）。 4、 枪头
买回的枪头摆放在枪头盒中高温高压灭菌，使用前放进超净台，盒子标明使用者，注意分开使用，长时间内未用完的枪头需再次灭菌；同时需注意尽量精简超净台的使用空间。 5、一次性无菌针头滤器
一次性针头滤器为Millipore生产的0.22 μm无菌包装，可直接使用。 6、一次性无菌针头注射器
一次性针头注射器为国产新苏公司生产的无菌包装，可直接使用。
三、细胞复苏
（1）超净台紫外杀菌，取出培养液置于传递窗中。
（2）杀菌到时后，进入细胞间，穿好实验服，戴上口罩与乳胶手套。 （3）关闭紫外，培养液转入超净台前先喷洒酒精。
（4）酒精棉擦手后，先在超净台中取出10 mL含血清培养液，置于15 mL离心管中待用。
（5）准备一杯37 ?C左右的温水，将细胞取出液氮罐，放入温水中。 （6）用镊子夹住冻存管，轻轻摇晃，使其快速溶解。 （7）待冻存管中液体解冻后，迅速放入传递窗中。 （8）超净台中擦拭冻存管，过火旋松。
（9）将冻存管中液体转入事先准备好的完全培养液中，800 rpm离心4 min。离心完成后弃上清（返回超净台后注意擦拭手套与管口，动作轻柔以防细胞散开重回到上清液中），加3 mL培养液重悬，转入细胞培养瓶中，再用3 mL培养液清
洗离心管，防止细胞残余。盖好瓶盖后放入培养箱中，24 h后观察，如有必要，进行换液。
（10）清理超净台，将培养液放回冰箱。
四、细胞传代
（1）先将培养液与胰酶放入传递窗中预热，同时将废液缸和PBS放入超净台中紫外灭菌20-30 min（台面擦拭干净）。
（2）灭菌完成后，将细胞从培养箱中取出，放入传递窗中。 （3）进入缓冲间穿好实验服，戴上口罩和乳胶手套。
（4）关闭紫外，细胞、胰酶与培养液转入超净台前先喷洒酒精。 （5）超净台中酒精棉擦手，再将培养瓶和试剂瓶依次擦净，过火旋松。 （6）将培养瓶中液体轻轻倒去，注意与废液缸口保持距离。
（7）PBS清洗培养瓶1-2次（液体不要直接冲洗贴壁面瓶壁，移液枪枪身不要接触瓶口）。
（8）取适量胰酶加入到培养瓶中，盖上瓶盖，将培养瓶平放并轻轻摇晃，使胰酶覆盖整个瓶壁，随后倒去胰酶（注意瓶口过火）。
（9）以培养瓶中残余的胰酶消化细胞，待到瓶壁上的细胞可见将要脱落或已经开始脱落，即加入培养液终止消化。
（10）用5 mL枪头或10 mL移液管吸取培养瓶中液体轻轻吹打瓶壁，吹打干净后将培养液转入离心管中，800 rpm离心4 min。
（11）离心完成后弃上清（注意动作轻柔以防细胞损伤），加入新鲜培养液重悬，吹打均匀以防细胞团聚。
（12）按传代的接种密度将所需用量的重悬液转入培养瓶中，补加适量的培养液，盖好瓶盖。
（13）将其他的试剂瓶盖子盖好，并将超净台面收拾干净，取出废液缸。 （14）将培养瓶放入培养箱中培养，其他试剂瓶放回冰箱中；废液缸清空并冲洗。
五、细胞冻存
（1）将小管装的FBS与DMSO置于传递窗中升至室温。
（2）PBS与废液缸放入超净台中紫外杀菌（台面擦拭干净），培养液与胰酶放入传递窗预热。
（3）灭菌完成后，将细胞从培养箱中取出，置于传递窗中。 （4）进入缓冲间，换好实验服，戴上乳胶手套和口罩。 （5）将细胞与试剂瓶转入超净台中，转入前注意喷洒酒精。 （6）酒精棉擦手，依次擦拭试剂瓶与培养瓶，过火旋松瓶盖。
（7）离心管中按所需用量配制冻存液：70 %培养液，20 % FBS（FBS比例可再提高），10 % DMSO。吹打混匀，过火盖盖。
（8）倒去培养瓶中的培养液，PBS (5mL)冲洗1-2次。
（9）加入胰酶(1mL)，盖上盖子后平放轻摇瓶身，使胰酶覆盖贴壁面瓶壁，随后倒去胰酶。
（10）以残余胰酶消化细胞，待细胞将要脱落或已经开始脱落，即加入培养液终止消化。
（11）用移液枪或移液管轻轻吹打瓶壁，收集细胞。 （12）将培养瓶中液体转入离心管中，800 rpm离心4 min。
（13）离心完成后弃上清（返回超净台中注意擦拭手套与管口），注意动作轻柔，不要将已沉淀的细胞重新摇晃回液体中。 （14）加入冻存液，重悬细胞。
（15）打开准备好的冻存管，将重悬的细胞分别装入冻存管中。 （16）写上细胞名称、传代次数、冻存日期和冻存者姓名，封口膜封口。 （17）将试剂瓶瓶盖盖好，超净台擦拭干净。 （18）冻存管放入冻存盒中，转入-80 ?C冰箱中过夜。 （19）试剂瓶放回冰箱中，废液缸清理干净。
（20）第二天将冻存盒中的细胞转入液氮罐中保存，记下冻存位置。 （21）隔天后取出一管细胞复苏，检测冻存效果，并在保存记录中注明。
六、超净台使用
平时超净台内仅可放置移液枪，待进行操作时将实验所需的试剂耗材等转入超净台中紫外杀菌，打开紫外前注意用酒精棉擦拭台面；实验操作过程中，注意物品在超净台中的摆放位置，不要使操作过程变得过长繁琐，以实际操作时间与细胞暴露于空气的时间达到最小为最佳；做完实验后，熄灭酒精灯，将所有物品移出超净台，清理台面。
七、培养箱使用
培养箱所处房间平日需关上隔间门，每次打开培养箱前，需将手洗净或用酒精棉擦拭，打开过程应及时迅速，取出培养瓶后，瓶子应尽量保持平放状态，但同时需注意不要使瓶内培养液触及瓶口部位；显微镜下观察细胞，用时不要过长。培养箱水盘中的纯水需定期更换，并清洗后用酒精棉擦拭水盘。
培养箱清理：如有培养液打翻，需及时清理，用酒精棉擦拭干净；每个月定期清理培养箱一次，用酒精棉擦拭；待到长假期间，细胞间所有人员均暂停细胞培养时，用84消毒液或新洁而灭溶液喷洒消毒，补喷氨水加速消毒液的散发。
八、冰箱使用
培养液、双抗与PBS放置于海尔冰箱（4?C）中，胰酶、MTT、DMSO（15 mL离心管分装）等其他试剂放置于西门子冰箱冷藏室（4?C）中，购回分装好的FBS与配置的胰酶放置于西门子冰箱冷冻室（-20 ?C）中，已解冻使用的FBS与胰酶放置于4?C冰箱中保存。
九、细胞间清理
每次超净台操作完后，将所有物品均移出超净台，试剂放回冰箱，垃圾带出细胞间，保持细胞间的整洁。每周末清理一次细胞间，将地面打扫干净，紫外杀菌2小时。
十、染菌清理
当发现细胞染菌后，立即将细胞丢弃，以防污染培养箱内其他细胞；使用玻璃培养瓶时应及时消毒（高温高压）后再倒掉培养液，浸泡酸缸过夜后中洗净继续高温高压灭菌备用。
十一、灭菌注意事项
使用高温高压灭菌锅时，注意一次灭菌物品不要过多，防止锅内蒸汽流通不畅，影响灭菌效果；灭菌锅内灌注去离子水，每隔一段时间（一月）灭菌完成后需打开放水阀，排除锅内去离子水，以防阀门生锈堵塞；灭菌时间已设定为1 h，超过1 h还未完成，需立即关闭电源，待锅内压力与气温下降之后检查原因，如有必要进行报修。
细胞培养操作过程
